一种甘蔗体细胞胚及其诱导方法技术

本发明专利技术涉及体细胞胚诱导技术领域。本发明专利技术提供了一种甘蔗体细胞胚及其诱导方法，包括如下步骤：1)将甘蔗细胞在DEM培养基中培养11～17天；(2)将甘蔗细胞转移到含有G418的DEM培养基中培养8～12天，然后在含有G418的DEM培养基继代培养8～12天，筛选存活的甘蔗细胞；(3)将存活的甘蔗细胞转移到含有G418的NB培养基上筛选培养8～12天，继代转接到含有G418的NB培养基中筛选8～12天，得到甘蔗体细胞胚。本发明专利技术通过对甘蔗直接体细胞胚诱导条件的探索优化，发现不同甘蔗品种对培养基的适应性不同，优化了甘蔗直接体细胞胚诱导的培养条件，能够在较短周期内获得转基因甘蔗植株。短周期内获得转基因甘蔗植株。短周期内获得转基因甘蔗植株。

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗体细胞胚及其诱导方法
[0001]本专利技术要求申请号为202210787134.7，申请日为2022年7月6日，专利名称为“一种甘蔗体细胞胚及其诱导方法”的中国专利申请的全部优先权。


[0002]本专利技术涉及体细胞胚诱导
，尤其涉及一种甘蔗体细胞胚及其诱导方法。

技术介绍

[0003]甘蔗是我国最主要的糖料作物，甘蔗的遗传转化通常是通过间接体细胞胚发生来实现的，具体来说通过甘蔗顶端未成熟叶脱分化
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愈伤组织
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再分化这一程序来进行的。用甘蔗胚性愈伤组织作为转化受体材料的遗传转化方案需要较长的植物组织培养周期，经过长期的培养可能会导致体细胞无性系变异的增加，不利于转化后的筛选，而且这种方法的转化效率非常低，所以我们对甘蔗遗传转化的改进应该聚焦在优化组织培养体系或寻找更加高效的甘蔗遗传转化受体材料，以提高转化效率和筛选效率进而缩短甘蔗转基因周期为主要目标。目前，国内的甘蔗转基因依然主要是以甘蔗胚性愈伤组织为转化受体，这使得国内甘蔗转基因进展缓慢，所以需要针对本地品种进行开发并优化以直接体细胞胚发生为基础的新方案，加快国内的甘蔗培育进程，为甘蔗及甘蔗病原菌功能基因的研究提供技术支撑。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种甘蔗体细胞胚及其诱导方法，为甘蔗及甘蔗病原菌功能基因的研究提供技术支撑。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种甘蔗体细胞胚的诱导方法，包括如下步骤：
[0007](1)将甘蔗细胞在DEM培养基中培养11～17天；
[0008](2)将甘蔗细胞转移到含有G418的DEM培养基中培养8～12天，然后在含有G418的DEM培养基继代培养8～12天，筛选存活的甘蔗细胞；
[0009](3)将存活的甘蔗细胞转移到含有G418的NB培养基上筛选培养8～12天，继代转接到含有G418的NB培养基中筛选8～12天，得到甘蔗体细胞胚。
[0010]作为优选，步骤(1)中所述培养的温度为24～28℃，光照强度25～35μmol m
‑2s
‑1，光照时间为10～14h/d。
[0011]作为优选，步骤(2)和步骤(3)中所述G418的浓度独立的为25～35mg/L。
[0012]作为优选，所述甘蔗为ROC22、中蔗1号或CP88
‑
1762；步骤(1)中所述甘蔗细胞为甘蔗顶端未成熟叶中的细胞，步骤(1)中所述甘蔗细胞为转基因甘蔗细胞。
[0013]作为优选，所述转基因甘蔗细胞的制备方法为：
[0014](1)将目的基因和pBWA(V)BU载体结合，得到HIGS干扰载体；
[0015](2)将HIGS干扰载体转化到感受态大肠杆菌中，诱导表达后提取质粒；
[0016](3)将质粒转化到甘蔗细胞中，得到转基因甘蔗体细胞；
[0017]所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HIGS干扰载体的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0018]本专利技术还提供了所述诱导方法得到的甘蔗体细胞胚。
[0019]本专利技术还提供了所述甘蔗体细胞胚的使用方法，包括如下步骤：
[0020](1)将甘蔗体细胞胚转入含有G418的SG培养基上培养，得到甘蔗幼苗；
[0021](2)将甘蔗幼苗炼苗后移栽到培养基中，得到甘蔗苗。
[0022]作为优选，步骤(1)中所述SG培养基中G418的浓度为15～25mg/L。
[0023]作为优选，步骤(1)中所述甘蔗幼苗的根长为2～3cm。
[0024]作为优选，步骤(2)中所述培养基包括如下体积份的原料：蛭石8～10份和营养土8～10份。
[0025]本专利技术提供了一种甘蔗体细胞胚及其诱导方法，包括如下步骤：1)将甘蔗细胞在DEM培养基中培养11～17天；(2)将甘蔗细胞转移到含有G418的DEM培养基中培养8～12天，然后在含有G418的DEM培养基继代培养8～12天，筛选存活的甘蔗细胞；(3)将存活的甘蔗细胞转移到含有G418的NB培养基上筛选培养8～12天，继代转接到含有G418的NB培养基中筛选8～12天，得到甘蔗体细胞胚。本专利技术通过对甘蔗直接体细胞胚诱导条件的探索优化，发现不同甘蔗品种对培养基的适应性不同，优化了甘蔗直接体细胞胚诱导的培养条件，能够在较短周期内获得转基因甘蔗植株。
附图说明
[0026]图1为不同品种在DEM培养基上培养七天的生长状态；
[0027]图2为不同品种在DEM培养基上培养十二天的生长状态；
[0028]图3为不同培养时间的受体材料；
[0029]图4为生根筛选培养及炼苗效果；
[0030]图5为中蔗1号不同区域在DEM培养基上的生长状态。
具体实施方式
[0031]本专利技术提供了一种甘蔗体细胞胚的诱导方法，包括如下步骤：
[0032](1)将甘蔗细胞在DEM培养基中培养11～17天；
[0033](2)将甘蔗细胞转移到含有G418的DEM培养基中培养8～12天，然后在含有G418的DEM培养基继代培养8～12天，筛选存活的甘蔗细胞；
[0034](3)将存活的甘蔗细胞转移到含有G418的NB培养基上筛选培养8～12天，继代转接到含有G418的NB培养基中筛选8～12天，得到甘蔗体细胞胚。
[0035]在本专利技术中，所述DEM培养基以MS培养基为基础，还包括4
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CPA1.86mg/L+NAA1.86mg/L+6
‑
BA0.09mg/L。
[0036]在本专利技术中，所述NB培养基优选以MS培养基为基础，还包括NAA1.86mg/L+6
‑
BA0.09mg/L。
[0037]在本专利技术中，步骤(1)中所述培养的时间优选为14天。
[0038]在本专利技术中，步骤(2)中所述培养的时间优选为10天。
NO.2所示的HIGS干扰载体；
[0069](2)将HIGS干扰载体转化到感受态大肠杆菌Top10中，诱导表达后提取质粒；
[0070](3)将质粒转化到甘蔗细胞中，得到转基因甘蔗体细胞；
[0071](4)将转基因甘蔗体细胞在DEM培养基中培养11天(温度28℃，光照强度35μmolm
‑2s
‑1，光照时间10h/d)；
[0072](5)将甘蔗细胞转移到含有25mg/L的G418的DEM培养基中培养8天，然后在含有35mg/L的G418的DEM培养基继代培养12天，筛选存活的甘蔗细胞；
[0073](6)将存活的甘蔗细胞转移到含有25mg/L的G418的NB培养基上筛选培养12天，继代转接到含有35mg/L的G418的NB培养基中筛选8天，得到甘蔗体细胞胚；
[0074](7)将甘蔗体细胞胚转入含有15mg/L的G418的SG培养基上培养，得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗体细胞胚的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将甘蔗细胞在DEM培养基中培养11～17天；(2)将甘蔗细胞转移到含有G418的DEM培养基中培养8～12天，然后在含有G418的DEM培养基继代培养8～12天，筛选存活的甘蔗细胞；(3)将存活的甘蔗细胞转移到含有G418的NB培养基上筛选培养8～12天，继代转接到含有G418的NB培养基中筛选8～12天，得到甘蔗体细胞胚。2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养的温度为24～28℃，光照强度25～35μmol m
‑2s
‑1，光照时间为10～14h/d。3.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述G418的浓度独立的为25～35mg/L。4.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述甘蔗为ROC22、中蔗1号或CP88
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1762；步骤(1)中所述甘蔗细胞为甘蔗顶端未成熟叶中的细胞，步骤(1)中所述甘蔗细胞为转基因甘蔗细胞。5.根据权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚伟，张木清，黄振，王彩霞，周宇明，段真珍，暴怡雪，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：