一种枣树茎尖脱毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种枣树茎尖脱毒的方法，包括材料预培养、二次切取茎尖、装载、玻璃化超低温处理、解冻、恢复培养的步骤。本发明专利技术通过优化配方的培养基中进行预培养，并二次切取茎尖，有效提高茎尖外植体的存活率，一定程度上解决了茎尖大小、成活率和脱毒率的矛盾。通过超低温冷冻疗法处理进行植原体脱毒，外植体成活率达50％，脱毒率为100％。因此该枣茎尖超低温冷冻脱毒技术可有效地脱除冬枣的植原体。冻脱毒技术可有效地脱除冬枣的植原体。

【技术实现步骤摘要】
一种枣树茎尖脱毒的方法


[0001]本专利技术属于植物病理学应用领域，具体涉及一种枣树茎尖脱毒的方法。

技术介绍

[0002]枣可鲜食易可干食，品种繁多，分布广泛。但是一直以来由植原体引起的枣疯病(jujube witches broom,JWB)不断发生，染病树结枣少，品质下降或绝产，一般情况下，染病后，小树1～2年、大树5～6年就全株死亡。目前可通过手术治疗、药物治疗及抗病品种筛选进行防治，但是在多数发病区此病害一直未被有效控制，故有“枣树癌症”之称。无性繁殖方式(根蘖苗和嫁接)是目前多数枣产区病园内苗期和幼树发病以及病害从病区传入无病区的主要原因。
[0003]目前枣树脱毒技术主要为茎尖组织培养结合热处理的方式。该方法存在处理时间长，热处理时间和温度不好把握，以及对茎尖截取大小要求较高等缺点，处理不当极易影响茎尖的成活率和脱毒率。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供一种枣疯病茎尖脱毒的方法。一种枣疯病茎尖脱毒的方法，包括下述1)
‑
5)的步骤：
[0005]1)材料预培养：春季取冬枣树患病主枝上摘下顶芽或腋芽，剥取茎尖，对茎尖消毒，消毒后将茎尖剥至2.5
‑
3.5mm,接种于预培养基1上，于光照强度为2000
‑
2500Lux，温度为25℃，湿度为60％，每天的光照时间为12hrs的条件培养,先培养20
‑
25d,然后取株高1.0
‑
2.0cm的再生芽,在超净工作台上分成单芽后,接种到预培养基2上继续培养20
‑
25天后得到培养好的外植体；所述预培养基1为WPM培养基中加入2mg/L 6
‑
BA、0.2mg/L NAA,琼脂7g/L,蔗糖30g/L，调pH 5.8，灭菌得到的固体培养基，所述预培养基2为MS培养基中加入2mg/L 6
‑
BA、0.2mg/L NAA、0.4mol/L蔗糖、0.4mol/L甘油和琼脂7g/L，调pH 5.8，灭菌得到的固体培养基；
[0006]2)装载
[0007]将步骤1)预培养好的外植体放在无菌环境下取含1
‑
3层叶原基的大小约2
‑
6mm的茎尖,将该茎尖放在装载液中，于25℃下处理,处理时间设置为30min。其中，装载液为玻璃化溶液2与MS液体培养基按照6:4的比例混合，调节pH5.8获得的溶液；玻璃化溶液2的配方：含终质量百分浓度为30％的甘油、终质量百分浓度为15％的二甲亚砜、终质量百分浓度为15％的乙二醇以及终浓度为0.4mol/L的蔗糖的溶液；
[0008]3)玻璃化超低温处理
[0009]将步骤2)装载后的茎尖从25℃取出后，继续在装载液中，0℃处理24h后，将茎尖浸入玻璃化溶液2，迅速投入装有液氮的液氮罐(
‑
196℃)中，处理40
‑
80min；
[0010]4)解冻
[0011]将茎尖从液氮中取出迅速投入40℃水浴锅中水浴化冻60
‑
100s,然后用1.2M蔗糖
溶液洗涤2
‑
4次,每次l0 min左右,直到茎尖漂浮在液体表面即可；
[0012]5)恢复培养
[0013]将洗涤后的茎尖尖转入添加2mg/L 6
‑
BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基上,暗培养7d后转移到光照强度为2000
‑
2500Lux，温度为25℃，湿度为60％，每天的光照时间为12h的条件中培养得到脱毒后的再生株系。
[0014]优选的，所述步骤2)中装载的茎尖长度为6mm。
[0015]优选的，所述步骤3)中，茎尖将茎尖浸入玻璃化溶液2，投入装有液氮的液氮罐中，处理的时间为40min。
[0016]与其他枣脱毒技术相比，该专利技术的优势在于降低了茎尖大小对成活率和脱毒效率影响，一般来说，枣茎尖脱毒取1
‑
10mm大小，而且茎尖的大小与成活率呈正比，与脱毒率呈反比。
[0017]本专利技术通过优化配方的培养基中进行预培养，并二次切取茎尖，有效提高茎尖外植体的存活率，一定程度上解决了茎尖大小、成活率和脱毒率的矛盾。通过超低温冷冻疗法处理进行植原体脱毒，外植体成活率达50％，脱毒率为100％。因此该枣茎尖超低温冷冻脱毒技术可有效地脱除冬枣的植原体。
附图说明
[0018]图1为外植体生长状态情况
[0019]图2为超低温冷冻疗法处理后脱毒枣苗生长情况。
[0020]图3为超低温冷冻疗法处理前后枣疯病植原体检测PCR产物凝胶电泳图
[0021]1‑
4泳道为超低温冷冻疗法处理后外植体；P1、P2为采样枝条上呈丛枝症状的枝条阳性对照。箭头所指为植原体16Sr RNA部分片段PCR扩增的目标条带。
具体实施方式
[0022]实施例1.枣疯病茎尖超低温冷冻疗法脱毒方法及其效果验证
[0023]一、枣疯病茎尖超低温冷冻疗法脱毒
[0024]1、培养基的配制
[0025]枣的植物组织培养的基本培养基为MS和WPM培养基。
[0026]1)MS培养基1所需母液
[0027]大量元素20mL(50
×
)，微量元素1mL(1000
×
)，钙盐10mL(1000
×
)，碘化钾1mL(1000
×
)，有机元素1mL(1000
×
)，铁盐5mL(200
×
)，肌醇0.1g，加入适量的植物激素，各种溶液配方见表1。
[0028]表1.MS培养基所需母液配方
[0029][0030][0031]2)培养基的配制
[0032]WPM木本植物专用培养基(不含蔗糖琼脂)购于木木生物公司，使用时称取2.78g，加入适量的植物激素(激素配比见表2)，琼脂7g/L,蔗糖30g/L，调pH 5.8，定容于1L蒸馏水中。
[0033]表2.激素6
‑
BA、NAA浓度配比
[0034]组合6
‑
BA(mg/L)NAA(mg/L)10020.50.231.50.2420.3520.2
[0035]2、超低温脱毒
[0036]1)材料预培养
[0037]a.剥取茎尖：在春季3
‑
4月份从罹患枣疯病的枣树患病主枝上摘下顶芽或腋芽，用清水洗干净，之后在超净工作台内将顶芽或腋芽剥去鳞片,剥出茎尖放入无菌水中,用无菌水冲洗3
‑
4次,进行无菌操作过程。
[0038]b.对茎尖消毒：先将茎尖用浓度75％酒精溶液浸泡40
‑
60s,用无菌水冲洗3
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4次。再用浓度0.1％的升汞溶液浸泡10min,无菌水冲洗5
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枣树茎尖脱毒，去除枣疯病植原体的方法，包括下述1)
‑
5)的步骤：1)材料预培养：春季取枣树患病主枝上摘下顶芽或腋芽，剥取茎尖，对茎尖消毒，消毒后将茎尖剥至3mm左右,接种于预培养基1上，于光照强度为2000
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2500Lux，温度为25℃，湿度为60％，每天的光照时间为12hrs的条件培养,先培养20
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25d,然后取株高1.0
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2.0cm的再生芽,在超净工作台上分成单芽后,接种到预培养基2上继续培养20
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25天后得到培养好的外植体；所述预培养基1为WPM培养基中加入2mg/L 6
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BA、0.2mg/L NAA,琼脂7g/L,蔗糖30g/L，调pH 5.8，灭菌得到的固体培养基，所述预培养基2为MS培养基中加入2mg/L 6
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BA、0.2mg/L NAA、0.4mol/L蔗糖、0.4mol/L甘油和琼脂7g/L，调pH 5.8，灭菌得到的固体培养基；2)装载将步骤1)预培养好的外植体放在无菌环境下取含1
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3层叶原基的长度2
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6mm的茎尖,将该茎尖放在装载液中，于25℃下处理,处理时间设置为30min；其中，装载液...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁红春，陈招荣，荣欣悦，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：