一种提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，方法如下：(1)挑选处于单核靠边期的乌菜花蕾，并预处理、消毒；(2)研磨花蕾，将研磨液过滤至烧杯中并离心，得纯合小孢子；(3)向NLN培养基中加入2.5～10mg/L 5

【技术实现步骤摘要】
一种提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法


[0001]本专利技术涉及遗传育种
，尤其涉及一种提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法。

技术介绍

[0002]乌菜(Brassica campestris L.ssp.Chinensis)是十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，杂种优势明显，但其常规杂交法育种年限较长，结合现代生物技术进行乌菜育种对提高其育种水平和效率至关重要。
[0003]游离小孢子培养技术是芸薹属蔬菜单倍体育种的一种重要的手段，其获得的DH植株是真正的纯系，且比传统的育种手段简单、高效，这大大减少了生产纯系所需的世代数，从而降低了育种计划时间和成本。
[0004]近几十年来，国内外的一些研究者关于十字花科蔬菜游离小孢子培养做了大量工作，致力于优化小孢子成胚和胚性培养物增殖体系，但目前尚有许多植物小孢子的胚胎发生率低、胚状体增殖率低，尤其是乌菜品种，这大大限制了这一技术在乌菜实际育种工作中的应用。
[0005]在植物中，DNA甲基化参与基因表达的调控，在植物生长发育过程中起着非常重要的作用，且目前许多实验结果都证实了这一点。如果甲基化不足或者太高，都会导致植物生长发育的不正常和形态异常；如拟南芥胚胎发育和种子生活力，均与DN4甲基化水平相关；脐橙DNA甲基化的频繁发生，致使它们的芽变频率比较高。因此，通过调控乌菜植物体胚的DNA甲基化水平，或能提高乌菜小孢子的胚胎发生率及增殖率。
[0006]5‑
氮胞苷(5
‑
AzaCytidine，5
‑
AzaC)是一种DNA甲基化抑制剂，为核苷类似物，能够选择性地使某些基因被激活，从而使一些真核细胞的分化状态得到改变。因此，可尝试将5
‑
AzaC用于乌菜植物体胚形成、增殖过程，以提高乌菜小孢子的胚胎发生率及增殖率。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种通过在培养基中添加5
‑
氮胞苷来提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法。
[0008]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0009]一种提高乌菜游离小孢子出胚率殖的方法，包括如下步骤：
[0010](1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的乌菜花蕾，并对其进行预处理、消毒；
[0011](2)对消毒后的花蕾进行研磨，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；随后，将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子；
[0012](3)向NLN培养基中加入2.5～10mg/L的5
‑
氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；
[0013](4)对步骤(3)所得产物进行热激处理后转入暗培养；待出现肉眼可见的胚状体
后，将其转移到摇床上振荡培养。
[0014]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，预处理指：将采摘的乌菜花蕾样本置于4℃环境下预冷处理24h。
[0015]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，消毒方法为：将预处理后的乌菜花蕾样本置于无菌环境下，依次进行70％酒精消毒30s、0.1％的HgCl2摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min。
[0016]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，研磨、过滤、离心的具体方法为：利用经过消毒的玻璃棒，在B5溶液中将花蕾碾碎，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的无菌小烧杯，获得滤液；将滤液用40μm细胞网筛进行第二次过滤，放入无菌离心管，在8000rpm下离心3min；之后，将上清液丢弃，沉淀用B5培养基进行重悬浮，再进行离心，将上清液丢弃，从而得到纯合小孢子。
[0017]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中，对纯化小孢子进行重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为1
×
105～5
×
105个/mL。
[0018]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中，将步骤(3)所得产物置于33℃下热激处理24h后转入25℃下暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到25℃摇床上以50rpm速度振荡培养，至形成子叶型胚状体。
[0019]一种提高乌菜胚性培养物增殖的方法，包括如下步骤：
[0020](1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的乌菜花蕾，并对其进行预处理、消毒；
[0021](2)对消毒后的花蕾进行研磨，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；随后，将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子；
[0022](3)向NLN培养基中加入2.5～10mg/L的5
‑
氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；
[0023](4)对步骤(3)所得产物进行热激处理后转入暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到摇床上振荡培养至形成子叶型胚状体；
[0024](5)将步骤(4)所得胚状体转移至MS固体培养基，并置于18
°
培养室以“光照14h黑暗10h”条件培养6～20天；其中，所述MS固体培养基中提前添加有2.5～10mg/L的5
‑
氮胞苷。
[0025]本专利技术相比现有技术的优点在于：
[0026](1)本专利技术在乌菜小孢子胚培养过程中，通过添加一定浓度的甲基化抑制剂“5
‑
氮胞苷(5
‑
AzaC)”于NLN培养基上，并置于摇床震荡培养，可以显著提高乌菜游离小孢子出胚率；
[0027](2)本专利技术通过添加一定浓度的甲基化抑制剂“5
‑
氮胞苷”于NLN培养基上，并置于摇床震荡培一段时间后转移至添加有5
‑
氮胞苷的MS固体培养基上，可以显著提高乌菜胚性培养物的增殖率，提高单倍体育种效率，为育种事业做贡献；
[0028](3)本专利技术提供的方法具有操作简单、生产高效等优点，且能够适用于各种品种的乌菜。
附图说明
[0029]图1是实施例1中暗培养过程中小孢子膨大示意图(为显微镜图，膨大的小孢子表
示：更有可能性会继续生长至子叶型或者其他类型胚)；
[0030]图2是实施例1中子叶型胚状体外观图(体视显微镜下图)；
[0031]图3是实施例4中光照14h黑暗10h条件培养20天后的植株图；
[0032]图4是实验例1中乌19品种乌菜在添加不同浓度5
‑
氮胞苷后的胚状体外观图(图中，A图为添加0mg/L 5
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氮胞苷的胚状体外观，B图为添加2.5mg/L 5
‑
氮胞苷的胚状体外观)；
[0033]图5是实验例3中2.5mg/L5
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AzaC+20d胚性培养物的外观图。
具体实施方式
[0034]下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的乌菜花蕾，并对其进行预处理、消毒；(2)对消毒后的花蕾进行研磨，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；随后，将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子；(3)向NLN培养基中加入2.5～10mg/L的5
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氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；(4)对步骤(3)所得产物进行热激处理后转入暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到摇床上振荡培养。2.根据权利要求1所述的提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，预处理指：将采摘的乌菜花蕾样本置于4℃环境下预冷处理24h。3.根据权利要求1所述的提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，消毒方法为：将预处理后的乌菜花蕾样本置于无菌环境下，依次进行70％酒精消毒30s、0.1％的HgCl2摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min。4.根据权利要求1所述的提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，研磨、过滤、离心的具体方法为：利用经过消毒的玻璃棒，在B5溶液中将花蕾碾碎，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的无菌小烧杯，获得滤液；将滤液用40μm细胞网筛进行第二次过滤，放入无菌离心管，在8000rpm下离心3min；之后，将上清液丢弃，沉淀用B5培养基进行重悬浮，...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪承刚，何云，袁凌云，唐小燕，陈国户，侯金锋，王文杰，吴建强，黄兴学，黄硕伟，张珮玉，
申请(专利权)人：安徽省皖江蔬菜产业技术研究院有限责任公司，
类型：发明
国别省市：