基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法及植株的倍性鉴定技术

本发明专利技术提供了一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，包括如下步骤：取杂交一代辣椒品种，在盛花期选取单核靠边期的花蕾，装入自封袋中；花蕾消毒；将花蕾置于无菌滤纸上，吸干表面水分后剥开花蕾，取花药；将花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种5～6个花粉粒；放入32～35℃培养箱中暗培养2～5d后，置于25℃、光照强度2000～2500lx、光照时间16h/d的培养室培养；转入生根培养基；待根部发育完全，开盖练苗，清洗根部培养基，移入营养钵。本发明专利技术设计了一种经胚状体途径诱导产生单倍体植株的方法，其步骤简单、实用，用时短，效率高，全程需要12周时间，大大提高了获得单倍体材料的进程。的进程。的进程。

【技术实现步骤摘要】
基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法及植株的倍性鉴定


[0001]本专利技术涉及农业
，尤其涉及一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法及再生植株的倍性鉴定方法。

技术介绍

[0002]辣椒(Capsicum annuum L)在我国广泛种植，是我国的第二大蔬菜栽培作物，在我国农业生产中占有重要地位。辣椒的营养价值很高，其果皮中含有丰富的蛋白质、维生素C、胡萝卜素以及钙、铁维等物质，其中维生素C的含量位居蔬菜之首，并且其食用烹任的方式多种多样，深受人们的喜爱。
[0003]辣椒属异花授粉作物，天然杂交率高，通过自交分离选育纯系一般需进行4～6代选择才能获得，不仅时间长，而且基因之间存在显隐性关系，因此很难选育出综合性状优良、具有突出优点且配合力强、适宜作为强优势亲本的品系。
[0004]单倍体育种作为一种新的育种途径，通过培育单倍体，然后对单倍体材料进行加倍，在较短时间内便可以选育出适宜作为强优势亲本的纯系，同时由于不存在基因间的显隐性作用，因此一些由隐性基因决定的性状便可以得到充分利用，这样既能大大缩短了育种年限，又能丰富所选优良品系的遗传基础，这样的品系易于实现亲本的选配。花药培养属于种质资源创制的重要辅助育种技术，不仅能缩短常规杂交育种所需的年限，提高选种效率，还能充分表现各种配子组合的基因型类型，在育种和机理研究中均具有很大潜力。应用花药培养技术可迅速得到纯合的双单倍体，大大加速育种进程；从开始培养到获得完全纯合DH系一般只需1～2年时间。
[0005]尽管花药培养在辣椒上开始较早，但其技术还不够成熟和完善。辣椒花药培养一般采用脱分化、再分化等愈伤组织诱导途径及生根壮苗等培养程序，步骤烦琐，诱导率低，再生成苗率低。经胚状体途径诱导产生单倍体植株的研究少有报道，并且从胚状体诱导产生单倍体植株的频率也并不乐观。因为许多胚状体不能正常的生长发育，或只产生根而不分化芽，成苗率低。
[0006]据此，目前迫切需要对影响辣椒花药培养胚状体诱导成苗因素进行系统性研究，旨在建立简单、高效的辣椒花药培养体系，为单倍体育种实践打下坚实的基础。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法及再生植株的倍性鉴定方法，该方法能够快速、稳定地获得大量单倍体植株。
[0008]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0009]一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，包括如下步骤：
[0010](1)选取杂交一代辣椒品种，在盛花期选取处于单核靠边期的花蕾，装入自封袋中置于4℃环境中24～48h；
[0011](2)取出花蕾，经流水冲洗后，置于超净工作台中用75％酒精消毒30～35s，再用
0.1％升汞杀菌10～15min，最后用灭菌的超纯水冲洗；
[0012](3)在超净工作台上，将消毒后的花蕾置于无菌滤纸上，待吸干其表面水分后剥开花蕾，取出花药；
[0013](4)将取出的花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种5～6个花粉粒，将三角瓶封口；
[0014](5)接种后随即放入32～35℃的恒温培养箱中暗培养2～5d后，置于温度25℃、光照强度2000～2500lx、光照时间16h/d的培养室进行40～60d培养；
[0015](6)待出苗后转入生根培养基中进行生根处理；待根部发育完全后，开盖练苗，清洗根部培养基，移入营养钵。
[0016]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，取蕾时间和选择标准：每天上午8：00以前或下午5：00以后从田间摘取生长健壮无病虫害的植株花蕾，花蕾的形态以“花瓣与花萼等长”或“花瓣露出花萼不超过2mm”为标准；每次从3～5株植株上取蕾，避免植株间差异；每隔3～4d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态。
[0017]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，应用滂酰紫6R染色法鉴定辣椒小孢子发育时期，从中筛选出处于单核靠边期的花蕾。
[0018]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，将花蕾进行消毒，流水冲洗20min后，在超净工作台中用75％酒精消毒30～35s，再用0.1％升汞杀菌10～15min，最后用灭菌的超纯水冲洗3次，每次5min。
[0019]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中，用灭菌后的镊子和解剖刀剥开花蕾，取出花药；并且过程中，注意避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。
[0020]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中，诱导培养基的配方为：MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.01～0.08mg/L BR+1～3mg/L TDZ+1～2mg/L AGP，pH5.8。
[0021]作为本专利技术的优选方式之一，所述诱导培养基的制备方法为：首先，在MS培养基中添加3％蔗糖、0.8％琼脂，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min后，冷却至60～70℃；冷却后，将0.01～0.08mg/L的BR、1～3mg/L的TDZ以及1～2mg/L的AGP采用过滤灭菌的方法加入上述冷却后的培养基中；最后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入30～40mL的培养基。
[0022]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(5)中，生根培养基的配方为：1/2MS+30g/蔗糖+8g/L琼脂+2mg/LNAA，pH5.8。
[0023]一种辣椒再生植株的倍性鉴定方法，采用该方法对上述获得的辣椒单倍体再生植株进行倍性鉴定，具体方法为：
[0024](1)植物形态学鉴定：
[0025]以“叶片小、节间缩短、生活力弱、花蕾不结实”这些外观表型特征为选择标准，对培养的各辣椒再生植株进行初步筛选，获得初步筛选疑似单倍体辣椒；
[0026](2)流式细胞术鉴定：
[0027]称量出筛选的初步筛选疑似单倍体辣椒叶片，放置在已经提前预冷的培养皿中；加入解离液，使整个叶片全部浸没在解离液中，使细胞核能充分解离；接着，用单面刀片切成长条状，切碎后吸取培养皿中的解离液，以使叶片中的细胞核进入解离液，再加入解离液进行稀释；最后，将稀释液移置流式细胞试管中，上机测定。
[0028]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，疑似单倍体辣椒的外观表型特征“叶片小、节间缩短、生活力弱、花蕾不结实”，均相对于二倍体植株的表型而言。
[0029]诱导培养基中外源添加物的功效原理：
[0030]油菜素内酯(brassinolide，简称BR)是以甾醇类为基本结构的具有生物活性的天然化合物，是一种新型的植物激素，同其他的五大类植物激素(生长素、赤霉素、乙烯、脱落酸和细胞分裂素)一样能够对植物的生长发育起重要的调节控制作用，被誉为“第六大激素”；
[0031]塞苯隆TDZ是一种新型的植物生长调节剂，它具有很强的细胞分裂素活性(CTK)，并且它的CTK活性要比一般的CTK高出几十倍甚至是几百倍，打破种子的休眠期，促进种子萌发；促进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取杂交一代辣椒品种，在盛花期选取处于单核靠边期的花蕾，装入自封袋中置于4℃环境中24～48h；(2)取出花蕾，经流水冲洗后，置于超净工作台中用75％酒精消毒30～35s，再用0.1％升汞杀菌10～15min，最后用灭菌的超纯水冲洗；(3)在超净工作台上，将消毒后的花蕾置于无菌滤纸上，待吸干其表面水分后剥开花蕾，取出花药；(4)将取出的花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种5～6个花粉粒，将三角瓶封口；(5)接种后随即放入32～35℃的恒温培养箱中暗培养2～5d后，置于温度25℃、光照强度2000～2500lx、光照时间16h/d的培养室进行40～60d培养；(6)待出苗后转入生根培养基中进行生根处理；待根部发育完全后，开盖练苗，清洗根部培养基，移入营养钵。2.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(1)中，取蕾时间和选择标准：每天上午8：00以前或下午5：00以后从田间摘取生长健壮无病虫害的植株花蕾，花蕾的形态以“花瓣与花萼等长”或“花瓣露出花萼不超过2mm”为标准；每次从3～5株植株上取蕾，避免植株间差异；每隔3～4d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态。3.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(1)中，应用滂酰紫6R染色法鉴定辣椒小孢子的具体发育时期，从中筛选出处于单核靠边期的花蕾。4.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将花蕾进行消毒，流水冲洗20min后，在超净工作台中用75％酒精消毒30～35s，再用0.1％升汞杀菌10～15min，最后用灭菌的超纯水冲洗3次，每次5min。5.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用灭菌后的镊子和解剖刀剥开花蕾，取出花药；并且过程中，注意避免损伤、损坏花药，并把花丝去...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪承刚，李红，侯金锋，唐小燕，袁凌云，陈国户，王文杰，吴建强，黄兴学，杨含军，张珮玉，
申请(专利权)人：安徽省皖江蔬菜产业技术研究院有限责任公司，
类型：发明
国别省市：