用于细胞重编程的组合物、构建体和载体制造技术

本公开涉及用于将细胞重编程为天然杀伤(NK)细胞或祖细胞的组合物、载体、构建体、细胞和方法。具体地，本公开涉及用于细胞的重编程的转录因子的组合。的转录因子的组合。的转录因子的组合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于细胞重编程的组合物、构建体和载体


[0001]本专利技术涉及使用转录因子的组合通过直接重编程来产生自体天然杀伤(NK)细胞和祖细胞。此外，本公开涉及通过引入和表达分离的/合成的转录因子从分化的、多潜能或多能干细胞制备具有细胞毒性能力的先天性淋巴细胞祖细胞和成熟细胞的方法的开发。具体而言，本公开提供了使用特定转录因子的组合通过直接细胞重编程来获得自体先天性淋巴细胞、特别是NK细胞的方法。

技术介绍

[0002]细胞重编程(Cellular reprogramming)是将一种细胞状态的转录和表观遗传网络改变为不同细胞类型的转录和表观遗传网络的过程。通过表达确定的转录因子(TF)，小鼠和人体细胞已被重编程为诱导多能干细胞(iPSC)(Takahashi等人,2006)。此外，体细胞可以直接重编程为替代的体细胞类型。通过使用具有指定靶细胞身份能力的TF，体细胞已被直接转化为其它成熟细胞命运，诸如肌细胞、神经元和肝细胞(Pereira等人,2012)。在造血系统中，直接重编程已被用于从小鼠和人成纤维细胞产生造血祖细胞(Pereira等人,2013,Gomes等人,2018)和树突细胞(Rosa等人,2018)。直接重编程正在成为研究细胞身份和定型的有力方案。内在谱系选择是随机的，并且取决于谱系特异TF的活化，后者然后通过与替代谱系特异因子的交叉拮抗相互作用锁定细胞命运(Graf和Enver,2009)。尽管最近淋巴细胞在癌症免疫疗法中取得了成功，但尚未报道通过直接细胞重编程来产生淋巴样细胞。
[0003]NK细胞代表一组独特的控制病毒感染和癌症的先天性淋巴样细胞(ILC)。尽管在胸腺中检测到一些NK细胞生成，但骨髓是在成人产生NK细胞祖细胞和成熟NK细胞的主要部位(Vivier等人,2011)。NK细胞存在于不同的组织中，诸如外周血、脾和淋巴结，以及肝；肝是在胎儿生命期间的血细胞生成和NK细胞产生的活跃部位(Renoux等人,2015)。几种转录因子对NK细胞的产生和功能而言是重要的，但是其中许多也与其它血液谱系的调节有关。ETS1表达启动于淋巴样祖细胞，并与早期淋巴样定型以及NK终末分化有关。ETS1与NFIL3一起调节NK细胞转录网络，活化ID2和EOMES表达。TBET和EOMES都是NK细胞功能特性(诸如IFN
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γ产生)所必需的。即使TBET由其它ILC表达，但EOMES仅限于NK细胞谱系，并且EOMES在TBET
+
细胞中的异位表达诱导NK细胞样特征。尽管这些单独的TF在NK生物学中是重要的，但在其它细胞类型中指示NK身份的关键组合是未知的。基于计算预测，已经提出TF RORα、SMAD7、FOS、JUN和NFATC2具有这样的作用(WO 2019/177936)。总体而言，尚未报道通过直接细胞重编程成功产生NK细胞。
[0004]与T细胞不同，NK淋巴细胞可以直接识别和清除靶细胞，而不需要抗原特异性。相反，NK细胞杀伤依赖于来自NK细胞表面处的活化受体和抑制受体的信号的平衡(Noriko等人,2020)。因为它们被主要组织相容性复合物(MHC)I类分子抑制，NK淋巴细胞会清除在表面下调MHC
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I的肿瘤细胞，而不与健康组织发生反应，这支持它们的临床效用。临床前数据已经广泛证明了NK细胞的抗肿瘤活性，从而证明了它们能够清除非T细胞靶向的MHC
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I阴性
癌细胞，增加免疫细胞浸润(Bottcher等人,2018,Barry等人,2018)，并且重要的是，通过清除循环肿瘤细胞来预防转移(Lopez
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Soto等人,2017)。此外，NK细胞的细胞因子分泌谱不同于T淋巴细胞，T淋巴细胞产生与细胞因子释放综合征的发作相关的促炎性细胞因子。因此，基于NK的免疫疗法比过继性T细胞策略更安全(Lopez
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Soto等人,2017)。已经证明，从外周血分离的或从脐带造血祖细胞分化的NK细胞的过继转移的临床研究是安全的，并表现出对造血系统癌症的效力(Bachanova等人,2014,Passweg等人,2004)。然而，难以从外周血或脐带血中大量获得原代NK细胞。NK细胞系NK92也已经在临床试验中进行了试验，具有最小的副作用，尽管对照射这些细胞的需要会限制NK92细胞在注射后的持久性(Tam等人,2003)。在实体瘤中，免疫抑制微环境会抑制NK细胞浸润和活化。但是，已经开发了几种策略来利用NK细胞以最大化其在实体癌中的浸润和抗肿瘤活性。正在开发具有嵌合抗原受体(CAR)的工程化NK细胞，以将NK淋巴细胞导向具有特定抗原的肿瘤细胞，从而增加NK细胞的抗肿瘤活性。在临床前研究中，同种异体iPSC
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衍生的CAR NK细胞在卵巢异种移植模型中表现出预防肿瘤进展和促进持续长期存活的能力(Ye Li等人,2018)。总之，这些研究证实，原代和iPSC
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衍生的同种异体NK细胞是安全的，并且引起最小的移植物抗宿主病。尽管如此，将NK细胞与iPSC区分开的方案复杂且耗时，需要添加多种细胞因子组合并与饲养层共培养。这些局限性对自体iPSC
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NK细胞的快速制造和及时递送提出了挑战，并且尽管同种异体NK细胞已被证明是安全的，但它们可能会受到接受者的免疫系统的排斥，从而表现出有限的持久性(WO 2019/177936)。MHC
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I基因编辑是被提出的一种替代方案；但是，MHC
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I阴性细胞可能会被宿主NK细胞排斥，并且NK细胞需要细胞固有的MHC
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I才能维持其功能(Boudreau等人,2016)。
[0005]因此，需要允许直接产生NK细胞的新方案，所述NK细胞可以同时进行遗传工程化并对癌症免疫疗法具有令人信服的价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的专利技术人已经开发了一种产生NK细胞的新方法，该方法是快速的且可再现的。具体地，所述方法包括产生自体NK细胞，所述自体NK细胞在体内具有高持久性，使其适用于免疫疗法。本专利技术还涉及已经被证实在NK细胞中富集的转录因子的组合，其可用于将细胞重编程为NK细胞。
[0007]在一个方面，本专利技术提供了至少一种多核苷酸，其编码至少三种不同转录因子的组合，所述转录因子选自由以下项组成的组：ETS1、TBET、NFIL3、EOMES、ID2、GATA3、ZFP105、IKZF3、ETS1、TOX、RUNX3、KLF12、ZEB2、IRF2、STAT5、IKZF1、ELF4、ZBTB16、GATA2和ELF1。
[0008]在另一个方面，本专利技术涉及至少一种多核苷酸，其编码至少三种不同转录因子的组合，所述转录因子选自由以下项组成的组：ETS1、TBET、NFIL3和EOMES。
[0009]在一个方面，本专利技术涉及一种构建体或载体，其包含如本文描述的至少一种多核苷酸。
[0010]在一个方面，本专利技术提供了一种细胞，其包含如本文描述的至少一种多核苷酸和/或构建体或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.至少一种多核苷酸，其编码至少三种不同转录因子的组合，所述转录因子选自由以下项组成的组：ETS1、TBET、NFIL3和EOMES。2.根据权利要求0所述的至少一种多核苷酸，其中所述至少三种转录因子的组合是四种转录因子ETS1、TBET、NFIL3和EOMES的组合。3.根据前述权利要求中任一项所述的至少一种多核苷酸，其中所述至少三种转录因子的组合包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ.ID.NO:1至SEQ.ID.NO:6。4.根据前述权利要求中任一项所述的至少一种多核苷酸，其中所述至少三种转录因子的组合由选自由以下项组成的组的多核苷酸序列编码：SEQ.ID.NO:22至SEQ.ID.NO:27，或与其具有至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％序列同一性的序列。5.根据前述权利要求中任一项所述的至少一种多核苷酸，其中所述转录因子ETS1包含氨基酸序列SEQ.ID.NO:1或其生物活性变体。6.根据权利要求FejI！Henvisningskilde ikke fundet.,所述的至少一种多核苷酸，其中编码SEQ.ID.NO:1的多核苷酸是SEQ.ID.NO:22，或与其具有至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％序列同一性的序列。7.根据前述权利要求中任一项所述的至少一种多核苷酸，其中所述转录因子TBET包含氨基酸序列SEQ.ID.NO:2或其生物活性变体。8.根据权利要求FejI！Henvisningskilde ikke fundet.,所述的至少一种多核苷酸，其中编码SEQ.ID.NO:2的多核苷酸是SEQ.ID.NO:23，或与其具有至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％序列同一性的序列。9.根据前述权利要求中任一项所述的至少一种多核苷酸，其中所述转录因子NFIL3包含氨基酸序列SEQ.ID.NO:3或其生物活性变体。10.根据权利要求FejI！Henvisningskilde ikke fundet.,所述的至少一种多核苷酸，其中编码SEQ.ID.NO:3的多核苷酸是SEQ.ID.NO:24，或与其具有至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％序列同一性的序列。11.根据前述权利要求中任一项所述的至少一种多核苷酸，其中所述转录因子EOMES包含氨基酸序列SEQ.ID.NO:4或其生物活性变体。12.根据权利要求FejI！Henvisningskilde ikke fundet.,所述的至少一种多核苷酸，其中所述生物活性变体包含选自由以下项组成的组的序列：SEQ.ID.NO:5至6。13.根据权利要求FejI！Henvisningskilde ikke fundet.,所述的至少一种多核苷酸，其中编码SEQ.ID.NO:4至6的多核苷酸选自由以下项组成的组：SEQ.ID.NO:25、SEQ.ID.NO:26和SEQ.ID.NO:27，或与其具有至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％序列同一性的序列。14.根据前述权利要求中任一项所述的至少一种多核苷酸，其中所述至少三种转录因子的组合选自由以下项组成的组：ETS1、TBET、NFIL3和EOMES；ETS1、TBET和NFIL3；ETS1、TBET和EOMES；ETS1、NFIL3和EOMES；和TBET、NFIL3和EOMES。
15.根据前述权利要求中任一项所述的至少一种多核苷酸，其中所述组合进一步包含一种或多种选自由以下项组成的组的转录因子：ID2、GATA3、ZFP105、IKZF3、TOX、RUNX3、KLF12、ZEB2、IRF2、STAT5、IKZF1、ELF4、ZBTB16、GATA2和ELF1。16.构建体或载体，其包含根据权利要求0至15中任一项所述的至少一种多核苷酸。17.根据权利要求16所述的构建体或载体，其中所述载体是病毒载体。18.根据权利要求17所述的构建体或载体，其中所述载体选自由以下项组成的组：慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、黄病毒载体、棒状病毒载体、副粘病毒载体、腺相关病毒载体、呼肠孤病毒载体、乳头状瘤病毒载体、小核糖核酸病毒载体、杯状病毒载体、肝脱氧核糖核酸病毒载体、披膜病毒载体、冠状病毒载体、肝炎病毒载体、正粘病毒载体、布尼亚病毒载体和丝状病毒载体。19.根据权利要求17所述的构建体或载体，其中所述病毒载体是慢病毒家族的成员。20.根据权利要求16至19中任一项所述的构建体或载体，其中所述载体是溶瘤载体。21.根据权利要求16至20中任一项所述的构建体或载体，其中所述构建体或载体是合成的mRNA、裸甲病毒RNA复制子或裸黄病毒RNA复制子。22.根据权利要求16至20中任一项所述的构建体或载体，其中所述载体进一步包含翻译后调节元件(PRE)序列。23.根据权利要求22所述的构建体或载体，其中所述PRE序列选自由以下项组成的组：土拨鼠PRE(WPRE)或乙型肝炎病毒(HBV)PRE(HPRE)。24.根据权利要求16至23中任一项所述的构建体或载体，其中所述载体进一步包含启动子序列，所述启动子序列控制根据权利要求FejI！Henvisningskilde ikke fundet.,至15中任一项所述的至少一种多核苷酸的转录。25.根据权利要求24所述的构建体或载体，其中所述启动子序列选自由以下项组成的组：脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、髓磷脂碱蛋白(MBP)启动子、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、含有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的经修饰的MoMuLV LTR(MNDU3)、泛素C启动子、EF
‑
1α启动子或鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。26.根据权利要求16所述的构建体或载体，其中所述构建体或载体是质粒。27.根据权利要求FejI！Henvisningskilde ikke fundet.,至26中任一项所述的构建体或载体，其中所述至少一种多核苷酸的至少三种转录因子从5
’
至3
’
呈选自由以下项组成的组的以下连续顺序：ETS1、TBET、NFIL3和EOMES；TBET、ETS1、NFIL3和EOMES；NFIL3、ETS1、TBET和EOMES；ETS1、NFIL3、TBET和EOMES；TBET、NFIL3、ETS1和EOMES；NFIL3、TBET、ETS1和EOMES；NFIL3、TBET、EOMES和ETS1；TBET、NFIL3、EOMES和ETS1；EOMES、NFIL3、TBET和ETS1；
NFIL3、EOMES、TBET和ETS1；TBET、EOMES、NFIL3和ETS1；...

【专利技术属性】
技术研发人员：I，
申请(专利权)人：阿斯加德治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：