一种提高枯草芽孢杆菌合成七烯甲萘醌的方法、获得重组菌株及其应用技术

本发明专利技术公开了一种提高枯草芽孢杆菌合成七烯甲萘醌的方法、获得重组菌株及其应用。本发明专利技术通过敲除枯草芽孢杆菌的nudF和yclB基因减少DMAPP消耗的同时强化细胞电子传递链的电子供应，促进MK

【技术实现步骤摘要】
一种提高枯草芽孢杆菌合成七烯甲萘醌的方法、获得重组菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及属于生物
，具体涉及一种提高枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）合成七烯甲萘醌的方法、获得重组菌株及其应用。

技术介绍

[0002]七烯甲萘醌（MK
‑
7）由甲基萘醌母环和母环 C
‑
3 位置上连接的 7 个异戊二烯单元的异戊二烯侧链组成。MK
‑
7对人体具有多种生理功能，在保护骨骼健康、预防心血管疾病等方面具有良好的效果，并且在糖尿病、慢性肾脏疾病、免疫紊乱和阿尔茨海默氏病等疾病的治疗方案中起着关键作用。作为维生素K2（Vitamin K2）的一种亚型，MK
‑
7在人体中具有亲缘性高、半衰期长等优点。
[0003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种食品安全级的模式生物，具有非致病性、遗传背景清晰、无密码子偏好性和基因操作工具齐全等优点，目前已广泛应用于生物合成和代谢工程领域的研究当中。枯草芽孢杆菌是MK
‑
7的主要生产者，MK
‑
7在枯草芽孢杆菌中的代谢过程主要分为四个模块：甘油异化途径、SA途径、MEP途径和MK
‑
7途径。枯草芽孢杆菌摄入甘油后经甘油异化途径和糖酵解途径合成甘油醛
‑
3磷酸（G3P）、丙酮酸（PYR）及磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），PYR与G3P经MEP途径的合成七异戊二烯基焦磷酸（HDP）为MK
‑
>7的合成提供异戊二烯侧链。PEP和赤藓糖
‑4‑
磷酸（E4P）进入SA途径合成分支酸（CHA），再通过MK
‑
7途径七步酶催化反应合成1, 4
‑
二羟基
‑2‑
萘甲酸（DHNA）为MK
‑
7的合成提供甲萘醌母环，最后HDP和DHNA通过1,4
‑
二羟基
‑2‑
萘酸庚二烯基转移酶（menA）和甲基转移酶（menG）的催化最终生成MK
‑
7。MEP途径是细菌中萜烯类化合物的主要合成途径，MK
‑
7的关键前体HDP需要依靠IPP的级联放大反应来合成。在异戊烯醇合成途径当中，nudF基因编码的核分布蛋白催化IPP和DMAPP分别合成两种互为同分异构体的异戊烯醇，这与MK
‑
7的合成途径形成竞争关系，通过敲除nudF来减少关键中间代谢产物DMAPP的消耗，有助于MK
‑
7关键前体HDP的合成。MK
‑
7在枯草芽孢杆菌的电子传递链中作为电子受体承担运输电子的功能，对枯草芽孢杆菌的生命活动具有重要意义。强化细胞电子传递链的电子供应来促进MK
‑
7合成是枯草芽孢杆菌合成MK
‑
7的工程改造方向之一，还原形式的黄素辅酶FMNH2通过将氢原子转移到MK
‑
7上来实现电子在细胞膜上的传递，从而形成枯草芽孢杆菌一系列的有氧呼吸活动。而yclB基因编码的酚酸脱羧酶催化FMNH2的戊基化过程，FMNH2的消耗削减了电子传递链中的电子供应量，yclB基因的敲除有助于增强细胞电子传递链中的电子供应。
[0004]虽然在MK
‑
7的研究中阻断产物合成途径中的分支途径是常用的改造策略，但是nudF和yclB两个基因并未直接出现在MK
‑
7的合成途径中，且通过敲除nudF和yclB基因来促进MK
‑
7的合成也未有相关研究报道。

技术实现思路

[0005]因此，本专利技术通过对菌株中公用中间代谢前体和电子传递共有受体进行综合分
析，选择基因nudF和yclB为改造靶点，采用了分别敲除或同时敲除分支代谢途径基因nudF和yclB的方法来增加MK
‑
7合成途径代谢通量和强化细胞电子传递链的电子供应，从而促进枯草芽孢杆菌中MK
‑
7的合成。
[0006]本专利技术首先提供一种提高枯草芽孢杆菌合成七烯甲萘醌的方法，所述的方法是在出发枯草芽孢杆菌中敲除nudF和yclB基因中一个或两个实现。
[0007]优选地，所述的方法是在出发枯草芽孢杆菌中同时敲除nudF和yclB基因实现。
[0008]在一个具体实施方式中，所述nudF基因的Genebank ID为938719，所述yclB基因的Genebank ID为938296。
[0009]优选实施方式中，所述出发枯草芽孢杆菌是野生型Bacillus subtilis. 168（简写BS168）的基础上敲除莽草酸途径的分支代谢途径中的dhbB、trpE和aroH基因，并敲除甘油异化途径的分支代谢途径中的mgsA基因。
[0010]具体地，所述敲除是采用CpfⅠ基因编辑或cre/lox重组系统实现。
[0011]本专利技术也提供所述的方法获得的高效合成七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌重组菌株。
[0012]本专利技术进一步提供所述的高效合成七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌重组菌株在生产七烯甲萘醌中的应用。
[0013]本专利技术因此提供一种生产七烯甲萘醌的方法，其通过培养所述的高效合成七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌重组菌株以产生七烯甲萘醌。
[0014]具体地，所述培养条件是在38
‑
42℃，150
‑
250 rpm的摇床中连续发酵2
‑
6天。任选地，进一步包括通过对发酵液进行细胞破碎和萃取收集七烯甲萘醌。
[0015]本专利技术通过敲除枯草芽孢杆菌的nudF和yclB基因减少DMAPP消耗的同时强化细胞电子传递链的电子供应，促进MK
‑
7的前体合成并且增强电子供应量，达到提高七烯甲萘醌高效合成的目的。实验表明，本专利技术分别敲除或同时敲除nudF和yclB得到的重组菌株，七烯甲萘醌的产量分别提升至野生型BS168的204%、183%、260%，因此具有较大的实用价值，有利于降低生产七烯甲萘醌的成本。
附图说明
[0016]图1是发酵96h后，BS168、BS1、BS2、BS3、BS4重组菌株发酵生产MK
‑
7的产量。
具体实施方式
[0017]为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。但需要说明的是，实施例并不构成对本专利技术要求保护范围的限制。
[0018]下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0019]菌株生长条件：枯草芽孢杆菌于37 ℃，200 rpm生长于LB 液体培养基，于40 ℃，200 rpm生长于发酵培养基。LB培养基成分包括5 g/L酵母浸粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，固体培养基在此基础上添加了17.5 g/L的琼脂；发酵培养基成分包括甘油30 g/L，大豆蛋白胨60 g/L，酵母浸粉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)合成七烯甲萘醌的方法，其特征在于，所述的方法是在出发枯草芽孢杆菌中敲除nudF和yclB基因中一个或两个实现。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法是在出发枯草芽孢杆菌中同时敲除nudF和yclB基因实现。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述nudF基因的Genebank ID为938719，所述yclB基因的Genebank ID为938296。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述出发枯草芽孢杆菌是野生型Bacillus subtilis. 168的基础上敲除莽草酸途径的分支代谢途径中的dhbB、trpE和aroH基因，并敲除甘油异化途径的分支代谢途径中的mgsA基因。5.如权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，付刚，朱启尧，李金龙，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：