用于生物合成烟酰胺核糖的表达载体、菌株、方法及应用技术

本申请涉及烟酰胺核糖技术领域，具体涉及用于生物合成烟酰胺核糖的表达载体、菌株、方法及应用。该表达载体携带有外运蛋白MdtL的第一编码基因和磷酸核糖转移酶NAMPT的第二编码基因，所述第一编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述表达载体被其宿主菌表达后于胞外分泌所述磷酸核糖转移酶，以催化烟酰胺向烟酰胺核糖的合成。转入了该表达载体的芽孢杆菌能于胞外表达磷酸核糖转移酶，而且其发酵产烟酰胺核糖的含量远高于在大肠杆菌中的生物合成量。的生物合成量。的生物合成量。

【技术实现步骤摘要】
用于生物合成烟酰胺核糖的表达载体、菌株、方法及应用


[0001]本申请涉及烟酰胺核糖
，具体涉及用于生物合成烟酰胺核糖的表达载体、菌株、方法及应用。

技术介绍

[0002]具有调节III型蛋白赖氨酸脱乙酰酶(Sirloins)活性能力的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide，NAD)被认为具有治疗癌症、帕金森病、肥胖、糖尿病及其他衰老相关疾病的潜力，NAD是Sirloins唯一的底物，NAD的水平高低直接决定了Sirloins家族的活性，而Sirloins活性又对细胞寿命有着重要的影响。但NAD难以直接进入细胞，因此需要通过补充其前体来提高NAD在细胞中含量，从而起到抗衰老等作用。在NAD各前体中，烟酰胺核糖(NR)能够被真核生物摄入后显著提高胞内NAD水平。基于这个特点，烟酰胺核糖被应用于抗衰老领域。同时，有相关研究表明，烟酰胺核糖能够有效改善糖尿病和神经系统疾病的临床症状；作为一种平台化合物，烟酰胺核糖被用来制备抗癌药。因此，烟酰胺核糖具有巨大的经济价值和应用前景，烟酰胺核糖的生产越来越受关注。
[0003]在烟酰胺核糖生产中，磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase，Nampt)已被报道能够显著地促进它的前体物(烟酰胺单核苷酸)的合成，进而合成烟酰胺核糖。采用生物合成法，例如在大肠杆菌中单独过表达磷酸核糖转移酶，但是表达量有限，并且不能有效实现生物合成烟酰胺核糖。

技术实现思路

>[0004]本申请专利技术人创造性地将转运蛋白MdtL和磷酸核糖转移酶NAMPT的编码基因进行共表达时，不仅能够于胞外表达磷酸核糖转移酶，而且其发酵产烟酰胺核糖的含量远高于在大肠杆菌中的生物合成量。为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
[0005](1)表达载体，其携带有外运蛋白MdtL的第一编码基因和磷酸核糖转移酶NAMPT的第二编码基因，所述第一编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述表达载体被其宿主菌的表达后于胞外分泌所述磷酸核糖转移酶，以催化烟酰胺向烟酰胺核糖的合成。
[0006](2)一株地衣芽孢杆菌，其携带有能够(1)所述的表达载体，所述表达载体被所述地衣芽孢杆菌在生长过程中转录、翻译和表达磷酸核糖转移酶。
[0007](3)一株枯草芽胞杆菌，其携带有能够(1)所述的表达载体，所述表达载体被所述枯草芽孢杆菌在生长过程中转录、翻译和表达磷酸核糖转移酶。
[0008](4)一株解淀粉芽胞杆菌，其携带有能够(1)所述的表达载体，所述表达载体被所述解淀粉芽孢杆菌在生长过程中转录、翻译和表达磷酸核糖转移酶。
[0009](5)表达载体的构建方法，所述表达载体(1)所述，所述构建方法包括：
[0010]获得第一编码基因的核酸分子和第二编码基因的核酸分子；
[0011]获得所述表达载体的基础载体片段；
[0012]将所述第二编码基因的核酸分子与所述基础载体片段进行连接，转入大肠杆菌，筛选得到第二阳性转化子，从而第二阳性转化在中分离得到携带所述第二编码基因的载体；
[0013]扩增携带所述第二编码基因的载体，得到携带所述第二编码基因的载体的线性载体片段；
[0014]将所述第一编码基因的核酸分子与所述线性载体片段进行连接，转入大肠杆菌，筛选得到第一阳性转化子。
[0015](6)一种重组芽孢杆菌的构建方法，包括：
[0016]获得(1)所述的表达载体；
[0017]将所述表达载体转入所述芽孢杆菌中，筛选得到阳性克隆，即为所述重组芽孢杆菌。
[0018](7)一种发酵产磷酸核糖转移酶的方法，包括：
[0019]获得(2)所述的地衣芽孢杆菌、或者(3)所述的枯草芽孢杆菌、或者(4)所述的解淀粉芽胞杆菌；以及
[0020]从(2)所述的地衣芽孢杆菌、或者(3)所述的枯草芽孢杆菌、或者(4)所述的解淀粉芽胞杆菌的发酵液中收获磷酸核糖转移酶。
[0021](8)一种发酵产磷酸核糖转移酶的方法，包括：
[0022]获得(2)所述的地衣芽孢杆菌、或者(3)所述的枯草芽孢杆菌、或者(4)所述的解淀粉芽胞杆菌；
[0023]接种至含烟酰胺的发酵培养基中发酵培养；以及
[0024]从发酵液的上清液中收获磷酸核糖转移酶。
[0025]与现有技术相比，上述方案(1)～(8)至少具有以下有益效果之一：
[0026]通过构建上述表达载体，能够将其转入不同类型的芽孢杆菌，例如将该表达载体分别转入了地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，依次得到的重组芽孢杆菌能够发酵含有烟酰胺的培养基，并表达磷酸核酸转移酶，以直接生物合成烟酰胺核糖。相较于其他转入了仅仅有磷酸核酸转移酶的重组菌株，本申请得到菌株的烟酰胺核糖产率提供至少9％，产量提高了至少30％。
附图说明
[0027]图1为本申请实施例提供的Nampt基因DNA片段验证胶图；M泳道为Maker，从上至下，DNA大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1泳道为目的条带。
[0028]图2为本申请实施例提供的pHY
‑
300载体片段验证胶图。M泳道为Maker，从上至下，DNA大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1泳道为目的条带。
[0029]图3为本申请实施例提供的质粒pHY
‑
Nampt钙转化菌落PCR验证胶图。M泳道为Maker，从上至下，DNA大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1泳道为目的条带。
[0030]图4为本申请实施例提供的mdtL(E.c)基因DNA片段验证胶图。M泳道为Maker，从上
至下，DNA大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1泳道为目的条带。
[0031]图5为本申请实施例提供以质粒pHY
‑
NampT为模板，扩增的载体片段验证胶图。M泳道为Maker，从上至下，DNA大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1泳道为目的条带。
[0032]图6为本申请实施例提供的pHY
‑
Nampt
‑
mdtL(E.c)钙转化菌落PCR验证胶图。M泳道为Maker，从上至下，DNA大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、75本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.表达载体，其携带有外运蛋白MdtL的第一编码基因和磷酸核糖转移酶NAMPT的第二编码基因，所述第一编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述表达载体被其宿主菌的表达后于胞外分泌所述磷酸核糖转移酶，以催化烟酰胺向烟酰胺核糖的合成。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述第一编码基因还包括第一启动子序列和第一终止子序列，所述第一启动子序列如SEQ ID NO.5所示，所述第一终止子序列如SEQ ID NO.6所示；所述第二编码基因还包括第二启动子序列和第二终止子序列，所述第二启动子序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二终止子序列如SEQ ID NO.4所示。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒载体；可选地所述质粒载体选自pHY
‑
P43、pHY300PLK、pBE2R(cm)
‑
mCitrine、pBE2R(cm)、pBE2R
‑
mCitrine、pBE2R
‑
P43
‑
EGFP
‑
HpaII
‑
Signal
‑
Hyg、pBE2R
‑
EGFP、pBE2R、pMA0911、pHT43
‑
SUMO
‑
GFP、pWB980、pHT43
‑
His、pHT43、pET
‑
37b(+)、pET
‑
27b(+)、pET
‑
26b(+)、pET
‑
25b(+)、pET
‑
22b(+)...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，周梦林，李祎，车浩天，占杨扬，蔡冬波，
申请(专利权)人：武汉茵智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：