一种基于T7RNA聚合酶的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统技术方案

本发明专利技术公开了一种基于T7RNA聚合酶的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统，属于生物技术领域。本发明专利技术构建的T7

【技术实现步骤摘要】
一种基于T7 RNA聚合酶的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统


[0001]本专利技术涉及一种基于T7 RNA聚合酶的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统，属于生物


技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以其清晰的遗传背景和成熟的基因操作技术，一直被作为研究革兰氏阳性细菌的模式微生物。此外，该菌株不会产生内毒素等有害产物，因此被美国食品药品安全监督管理局(FDA)认证为GRAS(Generally recognized as safe)菌株，是公认的食品安全级微生物。并且由于B.subtilis具有生长速率快、蛋白分泌能力强、无明显密码子偏好性及不易受噬菌体感染等优良特性，被广泛应用于构建细胞工厂生产各种工业产品，如重组蛋白、平台化学品和生物聚合物等。B.subtilis细胞工厂的构建依赖于有效表达蛋白质或调节合成途径中的关键基因的表达系统。基因表达系统通常分为组成型表达和诱导型表达系统，相较于组成型表达系统，诱导型表达系统的优势在于可以实现可控的基因表达，并且可以根据需要调节表达水平，避免一些对生长有影响的蛋白在生长前期表达对宿主细胞造成负担。
[0003]T7表达系统由T7噬菌体来源的T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)及其相应的T7启动子组成，被广泛用于E.coli中重组蛋白的生产。T7 RNAP对T7启动子具有较高的特异性，不作用于宿主的原生启动子，甚至不作用于类似的噬菌体T3启动子；而且，其延伸速度比大肠杆菌内源性RNA聚合酶快约5倍。此外，T7启动子可以产生很长的转录本，这有利于表达多顺反子基因，特别是一些天然产物的基因簇。此外，操纵子(例如lacO)可以插入到T7启动子上，用于诱导目的基因的转录。T7表达系统由于其遗传组成简单、启动子特异性高、可控性好，已被应用于各种宿主，甚至无细胞系统。
[0004]目前，B.subtilis中已经有多项基于T7 RNAP的蛋白表达与基因调控基系统构建和应用的研究(Castillo
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Hair et al.,2019；Chen et al.,2010；Conrad et al.,1996；Ji et al.,2021；Ye et al.,2022)。但他们都存在着一些问题，如使用P43启动子组成型表达T7 RNAP对细胞造成毒性并使得整个系统存在一定的泄漏表达，未对整个系统的表达进行优化以及这些系统仅局限于蛋白的表达，未被用于代谢途径的改造与调控。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于T7 RNA聚合酶的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统(two
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module T7
‑
based optimized output strategy for transcription(T7
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BOOST)systems)。T7
‑
BOOST系统由T7 RNA聚合酶(T7RNAP)驱动模块和表达控制模块组成，它可以和任意一个诱导型启动子及其操纵子相结合，通过T7 RNAP驱动模块中T7 RNA聚合酶自身的高效的转录能力与对T7启动子的专一性识别能力，不仅能够用于蛋白的高效表达，还可用于调控代谢产物的合成途径。将T7
‑
BOOST系统与枯草中最常用的两种诱导型表达系统(IPTG诱导型和木糖诱导型表达系统)相结合，提升其性能，使得整个系统在无诱导
剂的情况下超低泄露表达，添加诱导剂后高强度表达。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种基于T7 RNA聚合酶的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统，包括组成型表达的阻遏蛋白表达框、由诱导型启动子调控的T7 RNA聚合酶表达框、以及由杂合型T7启动子调控的目的基因；其中，所述杂合型T7启动子包括T7启动子和操纵子，所述的杂合型T7启动子受到阻遏蛋白的负向调控和T7 RNA聚合酶的正向调控。
[0007]进一步地，所述阻遏蛋白表达框、诱导启动子和T7 RNA聚合酶表达框位于第一载体上，用于整合在基因组上；所述杂合型T7启动子和目的基因位于第二载体上，用于游离表达目的基因。
[0008]进一步地，所述诱导型启动子选自P
hy
‑
spank
或P
xylA
。
[0009]进一步地，所述阻遏蛋白选自乳糖启动子的阻遏蛋白lacI或木糖启动子的阻遏蛋白xylR。
[0010]进一步地，所述操纵子选自乳糖操纵子lacO或木糖操纵子xylO。
[0011]进一步地，所述第二载体上连接有RBS序列。
[0012]进一步地，所述诱导型启动子P
hy
‑
spank
的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0013]进一步地，所述诱导型启动子P
xylA
的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0014]进一步地，所述T7 RNA聚合酶的Genbank登录号为NC_001604.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0015]进一步地，所述乳糖启动子的阻遏蛋白lacI的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0016]进一步地，所述木糖启动子的阻遏蛋白xylR的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0017]进一步地，所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0018]进一步地，所述乳糖操纵子lacO的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0019]进一步地，所述木糖操纵子xylO的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
[0020]进一步地，所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
[0021]本专利技术的第二个目的是提供上述双模块转录优化系统在生物合成中的应用。
[0022]进一步地，所述双模块转录优化系统用于枯草芽孢杆菌的蛋白表达。
[0023]进一步地，在适宜条件下培养含有双模块转录优化系统的基因工程菌，且培养体系中包括诱导物。
[0024]进一步地，所述诱导物根据诱导型启动子及操纵子的种类进行选择，如木糖异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)或木糖等。
[0025]进一步地，将上述基因工程菌在LB培养基中培养，培养条件为：35
‑
37℃，200
‑
220rpm，培养10
‑
15h，获得种子液；以2
‑
5％接种量将种子液接种到TB发酵培养基中，培养条件为：35
‑
37℃，200
‑
220rpm，培养14h
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96h。
[0026]进一步地，LB培养基为本领域常规培养基，每升组分包括：蛋白胨5
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15g，酵母粉1
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10g，NaCl 5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于T7 RNA聚合酶的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统，其特征在于：包括组成型表达的阻遏蛋白表达框、由诱导型启动子调控的T7RNA聚合酶表达框、以及由杂合型T7启动子调控的目的基因；其中，所述杂合型T7启动子包括T7启动子和操纵子，所述的杂合型T7启动子受到阻遏蛋白的负向调控和T7 RNA聚合酶的正向调控。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统，其特征在于：所述阻遏蛋白表达框、诱导启动子和T7 RNA聚合酶表达框位于第一载体上，所述杂合型T7启动子和目的基因位于第二载体上。3.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统在生物合成中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：对含有所述枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统的基因工程菌进行培养。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：培养体系中含有诱导物。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将所述基因工程菌在种子培养基中培养，获得种子液，再将种子液接种到发酵培养基中进行发酵生产。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述种子培养基为LB培养基。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基为TB培养基。9.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统在代谢调控中的应用。10.一种能进行代谢调控的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌含有权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌双模块转录优化系统。11.一种对枯...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，武耀康，李洋，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：