一种利用电荷识别效应测定多巴胺的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用电荷识别效应测定多巴胺的方法。将金电极用氧化铝粉抛光，依次在硝酸、无水乙醇和纯水泡洗，取出后超声洗涤５ｍｉｎ，即得到干净的裸金电极。将金电极放入１０－１５ｍＬ含０．０１ｍｏｌ／Ｌ半胱氨酸的０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液中６ｈ，即制得半胱氨酸修饰电极。然后电极再次在１０－１５ｍＬ含有０．０２ｍｏｌ／Ｌ？１－乙基－（３－二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和０．０４ｍｏｌ／Ｌ？Ｎ－羟基琥珀酰亚胺的０．０５ｍｏｌ／Ｌ二亚乙基三胺五乙酸的混合溶液中浸泡５ｈ，即可制得二亚乙基三胺五乙酸／半胱氨酸／金修饰电极。对人体血清样品ＤＡ的含量进行检测，常见的干扰物质抗坏血酸、尿酸及其他氧化电位与ＤＡ相近的物质未见有明显的干扰。本发明专利技术能够用来测量血清中多巴胺的浓度，制作简单，使用方便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，可用于人体血清样品中多巴胺的测定。
技术介绍
多巴胺(3，4-二羟基-P-苯乙胺，DA)是一种非常重要的神经递质，且与帕金森 病、亨丁顿舞蹈症和多动症等病症息息相关。目前，测量DA浓度的方法有很多，电化学方法 因灵敏度高、选择性好而广泛应用，尤其是电化学型生物传感器能够进行活体分析，这一优 点是其他方法无法比拟的。金刚石电极、玻碳电极、铂电极和金电极等裸电极都可以用来测 DA，但抗坏血酸(AA)和尿酸(UA)因为氧化还原电位与DA相近，从而干扰最终测定结果。 为了解决这个问题，人们做出了很多努力，例如离子交换膜、离子液体-凝胶膜、聚合膜和 自组装膜等。离子交换膜中最典型的膜就是Nafion膜，但Nafion膜有常见的几个缺点膜 厚度不均一、重现性差、响应时间长、价格昂贵，而自组装能够克服Nafion膜的这些缺点。 二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)是一个由五个羧基(pKa(电离平衡常数)1.9，2.9，4.4，8.7， 10.5)修饰二乙三胺的无机螯合物。目前还没有文献报道利用DTPA螯合物的静电识别来测 定DA。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高、选择性好可以对人血清样品中的多巴胺进 行测定的方法。 构思如下多巴胺在电极上明显的氧化还原峰，但是与多巴胺一同存在于血液中 的抗坏血酸也有明显的氧化还原峰，且峰电位与多巴胺的峰电位相近。通过二亚乙基三胺 五乙酸的电荷识别作用，多巴胺在电极上有响应，而抗坏血酸和尿酸则几乎没有响应，从而 达到消除干扰的目的。其基本原理是在pH为7. 4的磷酸缓冲溶液中，二亚乙基三胺五乙酸有五个羧基 (pKa 1.9，2.9，4.4，8. 7,10.5)，易带负电荷；多巴胺(pKa = 8.87)易带正电荷；而AA(pKa =4. 1)易带负电荷。根据电荷识别效应，带负电荷的二亚乙基三胺五乙酸吸引正电荷的多 巴胺而排斥带负电荷抗坏血酸，从而消除了抗坏血酸的干扰。 具体步骤如下 —、金电极的处理 将金电极用氧化铝粉抛光，依次在硝酸(体积比为1 : 1)、无水乙醇和纯水泡洗， 取出后超声洗涤5min，即得到干净的裸金电极。 二、修饰电极的制备 首先将金电极放入10-15mL含0. 01mol/L半胱氨酸的0. lmol/L的HC1溶液中6h， 即制得半胱氨酸修饰电极。然后电极再次在10-151^含有0.0211101/11-乙基-(3-二甲基 氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0. 04mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的0. 05mol/L 二亚乙基三3胺五乙酸的混合溶液中浸泡5h，即制得二亚乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修饰电极。 三、干扰实验 相对于5X 10—6mol/L的多巴胺、5X 10—5mol/L的抗坏血酸和5X 10—5mol/L尿酸分 别使多巴胺的峰电流增大了 0. 2%和1. 2%，表明5X10—5mol/L的抗坏血酸和5X 10—5mol/L 尿酸对5X 10—6mol/L的多巴胺无明显干扰，充分表明三胺五乙酸/半胱氨酸膜有良好的选 择性。 四、标准工作曲线的绘制取20mL小烧杯，加入含0. lmol/L KC1的0. 2mol/L磷酸缓冲溶液10mL，逐次加入 25 ii L 5. 0X 10—5、5. 0X 10—6mol/L多巴胺溶液，根据多巴胺浓度c与峰电流i写出线性方程 为i (ii A) = -3. 8575c-0. 8750 X 10—2，相关系数R为0. 9971 。 五、人体血清样品中多巴胺含量的测定将0. 5mL除掉人血清白蛋白(HAS)后的血样加入到4. 5mL 0. 2mol/L的磷酸缓冲溶液中，用标准加入法测人血清样品中多巴胺的浓度，并测量加标回收率。 本专利技术能够用来测量血清中多巴胺的浓度，且制作简单，使用方便。附图说明 图1为本专利技术实施例修饰电极的安培i-t曲线，施加电位0. 18V，磁力搅拌下连续 加入5. 0X10—5mol/L尿酸、5. 0X10—5mol/L抗坏血酸禾口 5. 0 X 10—6mol/L多巴胺。 图2为本专利技术实施例修饰电极的安培i-t曲线，施加电位0. 18V，磁力搅拌下连续 加入5. 0X10—5和5. 0X10—6mol/L多巴胺。具体实施方式 实施例 将金电极依次用1. 0 ii m、0. 3 ii m禾P 0. 05 ii m的氧化铝粉抛光，依次在硝酸(体积 比为1 : 1)、无水乙醇和纯水泡洗，取出后超声洗涤5min。将裸金电极放入含O. 01mol/L 半胱氨酸的0. lmol/L的10mL的HC1溶液中6h，即制得半胱氨酸修饰电极。此裸金电极如 果表面有其他杂质，则半胱氨酸很难修饰至电极上。然后再将制得的半胱氨酸修饰电极在 含有0. 02mol/L 1-乙基_(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0. 04mol/L N-羟基 琥珀酰亚胺的O. 05mol/L二亚乙基三胺五乙酸的10mL混合溶液中浸泡5h，即制得二亚乙基 三胺五乙酸/半胱氨酸/金修饰电极。 取20mL小烧杯，加入含0. lmol/L KC1的0. 2mol/L磷酸缓冲溶液10mL，搅拌的情 况下，逐次加入25ii L 5. 0X10—5、5. 0X10—Smol/L多巴胺溶液，多巴胺浓度与峰电流的安培 i-t曲线如图2，在1. 0X 10—7-6. 0X 10—3mol/L范围内，多巴胺浓度与氧化峰电流之间的线 性方程为i(iiA) = -3. 8575c-0. 8750X 10—2，相关系数R为0.9971，检出限(S/N = 3)为 3. 0X10—8mol/L。 用标准加入法测量人血清样品中多巴胺的浓度，为了避免人血清白蛋白的干扰， 将0. 2克的三氯乙酸加入到lmL血样中，在3000r/min的转速下离心10min，除掉沉淀的蛋 白质，再取0. 5mL清液转至4. 5mL 0. 2mol/L磷酸缓冲溶液中，利用伏安法对待测液进行测 量，扫描电压-O. 1V到0. 6V。读出峰电流值i。用i(iiA) =-3. 8575C-0. 8750X 10—2计算出C。即可知此血样中中所含多巴胺的量。lmin后，加入5.0X10—Smol/L多巴胺，测回收率。 结果见表1。测定结果的回收率在99. 6-100. 8%之间，表明此方法可以用来准确 测量血清中多巴胺的含量。 表l.人血清样品中多巴胺的含量和回收率 <table>table see original document page 5</column></row><table>权利要求，其特征在于具体步骤如下一、金电极的处理将金电极用氧化铝粉抛光，依次在体积比为1∶1的硝酸、无水乙醇和纯水泡洗，取出后超声洗涤5min，即得到干净的裸金电极；二、修饰电极的制备首先将金电极放入10-15mL含0.01mol/L半胱氨酸的0.1mol/L的HCl溶液中6h，即制得半胱氨酸修饰电极；然后电极再次在10-15mL含有0.02mol/L1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.04mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的0.05mol/L二亚乙基三胺五乙酸的混合溶液中浸泡5h，即制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用电荷识别效应测定多巴胺的方法，其特征在于具体步骤如下：一、金电极的处理：将金电极用氧化铝粉抛光，依次在体积比为１∶１的硝酸、无水乙醇和纯水泡洗，取出后超声洗涤５ｍｉｎ，即得到干净的裸金电极；二、修饰电极的制备：首先将金电极放入１０－１５ｍＬ含０．０１ｍｏｌ／Ｌ半胱氨酸的０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液中６ｈ，即制得半胱氨酸修饰电极；然后电极再次在１０－１５ｍＬ含有０．０２ｍｏｌ／Ｌ１－乙基－（３－二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和０．０４ｍｏｌ／ＬＮ－羟基琥珀酰亚胺的０．０５ｍｏｌ／Ｌ二亚乙基三胺五乙酸的混合溶液中浸泡５ｈ，即制得二亚乙基三胺五乙酸／半胱氨酸／金修饰电极；三、干扰实验：相对于５×１０↑［－６］ｍｏｌ／Ｌ的多巴胺、５×１０↑［－５］ｍｏｌ／Ｌ的抗坏血酸和５×１０↑［－５］ｍｏｌ／Ｌ尿酸分别使多巴胺的峰电流增大了０．２％和１．２％，表明５×１０↑［－５］ｍｏｌ／Ｌ的抗坏血酸和５×１０↑［－５］ｍｏｌ／Ｌ尿酸对５×１０↑［－６］ｍｏｌ／Ｌ的多巴胺无明显干扰，表明三胺五乙酸／半胱氨酸膜有良好的选择性；四、标准工作曲线的绘制：取２０ｍＬ小烧杯，加入含０．１ｍｏｌ／ＬＫＣｌ的０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲溶液１０ｍＬ，逐次加入２５μＬ５．０×１０↑［－５］、５．０×１０↑［－６］ｍｏｌ／Ｌ多巴胺溶液，根据多巴胺浓度ｃ与峰电流ｉ写出线性方程为ｉ（μＡ）＝－３．８５７５ｃ－０．８７５０×１０↑［－２］，相关系数Ｒ为０．９９７１；五、人体血清样品中多巴胺含量的测定：将０．５ｍＬ除掉人血清白蛋白后的血样加入到４．５ｍＬ０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲溶液中，用标准加入法测人血清样品中多巴胺的浓度，并测量加标回收率。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李建平，刘蓉，魏小平，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]