PSK3基因在促进紫花苜蓿遗传转化效率上的应用制造技术

本发明专利技术涉及PSK3基因在促进紫花苜蓿遗传转化效率上的应用，属于植物基因工程和基因编辑技术领域，本发明专利技术利用PSK3基因能够同时促进紫花苜蓿愈伤增殖和再生的优势，结合PSK3

【技术实现步骤摘要】
PSK3基因在促进紫花苜蓿遗传转化效率上的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程和基因编辑
，特别涉及PSK3基因在促进紫花苜蓿遗传转化效率上的应用。

技术介绍

[0002]紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，是全世界种植面积最大的饲草作物。叶茎比是决定紫花苜蓿生物量、蛋白质含量等重要农艺性状的关键指标之一，培育叶片数较多的品种可提高苜蓿的叶茎比，从而提高苜蓿的生物量和营养价值。Cys(2)His(2)锌指转录因子PALMate
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likePentafoliata1(PALM1)参与苜蓿侧小叶的起始和叶片初级形态的建成，丧失功能的蒺藜苜蓿PALM1突变体呈现裂叶表型，叶尖聚集有4
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5个小叶，可显著增加苜蓿的叶茎比。
[0003]除利用常规育种技术进行苜蓿种质创新和育种外，生物技术也不断被引入苜蓿育种工作中，并取得了重要突破，其中基因编辑技术为培育优异苜蓿新种质提供了新的技术途径。然而，当前大部分植物的基因编辑需要依靠遗传转化技术才能实现，因此如何提高遗传转化效率成为制约植物基因编辑的瓶颈之一。紫花苜蓿愈伤发生和再生效率低下，导致其遗传转化体系对品种和基因型依赖严重。另外，紫花苜蓿遗传背景复杂，基因组庞大，同源多倍体基因组相似度高，导致基因编辑效率低甚至不编辑，载体构建复杂，严重阻碍了基因编辑技术在紫花苜蓿遗传育种中的推广和应用。
[0004]植物愈伤形成与再生在细胞水平主要涉及细胞命运的转变和细胞全能性的建立。该过程受一系列调控植物胚胎发育的核心转录因子的协同控制。异源过表达上述核心转录因子，例如BabyBoom
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WUS2、GRF4
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GIF1、TaWOX5等，可作为分子辅助工具促进外植体的快速脱分化形成愈伤或加速愈伤再分化形成器官，从而显著降低了基因转化对外植体来源与基因型的要求。然而上述分子辅助工具无法同时实现愈伤快速增殖与高效再生，且很多分子辅助工具易致畸形，导致应用受限。PSK3基因编码一种磺化五肽生长因子(磺肽素)，能够同时促进愈伤快速增殖与高效再生。然而，之前报道多为磺化五肽生长因子的外源施加，该物质未商业化，其施加量随植物物种及品种的不同而波动较大，不稳定且重复性差)，并且至今未见该基因在植物组培快繁与遗传转化方面的使用。因此本专利PSK3同时促进紫花苜蓿愈伤增殖与再生，构建新的高效愈伤增殖与再生的遗传转化辅助分子工具，用于紫花苜蓿基因编辑和新种质的创制。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对上述技术问题提供一种PSK3基因在促进紫花苜蓿遗传转化效率上的应用，本专利技术载体是由一个组成型强启动子拟南芥Ubiquitin10的强启动子同时启动Cas9模块和sgRNA模块协同高效表达从而达到高效编辑的效果，而tRNA串联系统(使用tRNA将多个sgRNA串联表达)，可实现同一基因或不同基因多个靶位点的同时编辑。另本载体同时带有植物磺肽素编码基因Phytosulfokine3precursor(PSK3)和植物抗性筛选基因(hph/bar/
NPTⅡ)，其中PSK3基因可显著促进苜蓿愈伤增殖和再生。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：
[0007]PSK3基因在促进紫花苜蓿愈伤增殖和再生中的应用。
[0008]本专利技术还提供所述紫花苜蓿基因编辑载体系统的应用，所述系统编码相应PSK3蛋白质，提高紫花苜蓿愈伤发生和再生效率，所述载体系统为PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R，其中，Cas9以及sgRNA由拟南芥Ubiquitin10的强启动子启动表达。
[0009]本专利技术还提供一种基因编辑载体系统PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R
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KOPALM1，所述系统能用于MsPALM1基因编辑。
[0010]进一步，所述基因编辑载体系统中的PALM1基因为其它控制性状的基因。
[0011]本专利技术还提供利用PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R基因编辑载体系统获得多叶型紫花苜蓿的方法，所述方法包括如下步骤：
[0012](1)获取紫花苜蓿PSK3基因序列，设计引物；
[0013](2)根据已获得的PSK3基因序列，设计引物如下：
[0014]PSK3
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F：CATTTCATTTGGAGAGGACAATGAGGCTAAGTTTTATCTT
[0015]PSK3
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R：TCAAGGCTTATGATGTTGTG
[0016](3)从PEG100载体上扩增CaMV35Spromoter序列，设计引物如下：
[0017]35S
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PSK3
‑
F：TCCCGCCTTCAGTTTTGAGACTTTTCAACAAAGGA
[0018]35S
‑
PSK3
‑
R：TGTCCTCTCCAAATGAAATGA
[0019](4)从PEG100载体上扩增OCSterminator序列，设计引物如下：OCS
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PSK3
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F：ACATCATAAGCCTTGACTGCTTTAATGAGATATGCG OCS
‑
PSK3
‑
R：AAACACTGATAGTTTCTGCTGAGCCTCGACAGTT
[0020](5)使用高保真酶对PSK3、CaMV35Spromoter和OCSterminator3个片段进行PCR扩增，片段大小分别为369bp、346bp、708bp，以3个PCR反应产物为模板，进行二轮PCR反应，使用桥联方式把3个PCR反应产物连接成一个PSK3完整表达盒，连接引物序列如下：
[0021]35S
‑
PSK3
‑
F：TCCCGCCTTCAGTTTTGAGACTTTTCAACAAAGGA OCS
‑
PSK3
‑
R：AAACACTGATAGTTTCTGCTGAGCCTCGACAGTT
[0022](6)使用PmeⅠ限制性内切酶对CRISPR_2.0
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pRGEB31R载体进行单酶切并割胶回收，将5)回收的目的片段通过无缝连接方式连入到酶切后的CRISPR_2.0
‑
pRGEB31R载体，连接反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆并测序，将测序结果和已经报道的序列比对，将测序正确的菌落培养后提取PSK3
‑
CRISPR_2.0
‑
pRGEB31R载体质粒并在
‑
20℃保存；
[0023](7)获取紫花苜蓿MsPALM1基因序列，设计引物；
[0024](8)根据已经获得的紫花苜蓿MsPALM1基因序列，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PSK3基因在促进紫花苜蓿愈伤增殖和再生中的应用。2.一种紫花苜蓿基因组编辑载体系统的应用，其特征在于，所述系统编码相应PSK3蛋白质，提高紫花苜蓿愈伤发生和再生效率，所述载体系统为PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R。3.一种基因组编辑载体系统PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R
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KOPALM1，其特征在于，所述系统能编辑MsPALM1基因，获得多叶型紫花苜蓿。4.根据权利要求3所述的一种基因组编辑载体系统PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R
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KOPALM1，其特征在于，所述基因组编辑载体系统中的PALM1基因为其它控制紫花苜蓿性状的基因。5.利用PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R基因组编辑载体系统获得多叶型紫花苜蓿的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据已获得的PSK3、CaMV35Spromoter、OCSterminator基因序列，设计引物；(2)使用高保真酶对PSK3、CaMV35Spromoter和OCSterminator3个片段进行PCR扩增，片段大小分别为369bp、346bp、708bp，以3个PCR反应产物为模板，进行二轮PCR反应，使用桥联方式把3个PCR反应产物连接成一个PSK3完整表达盒；(3)使用PmeⅠ限制性内切酶对CRISPR_2.0
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pRGEB31R载体进行单酶切并割胶回收，将回收的目的片段通过无缝连接方式连入到酶切后的CRISPR_2.0
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pRGEB31R载体，连接反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆并测序，将测序结果和已经报道的序列对比，将测序正确的菌落培养后提取PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R载体质粒并在
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20℃保存；(4)获取紫花苜蓿MsPALM1基因序列，设计引物；(5)根据已经获得的紫花苜蓿MsPALM1基因序列，以及CRISPR载体设计原则，选取的四个靶位点分别为：
‘
GGAATATTATGAACACAACA
’
，
‘
CGGTCAGCTCAAGCTCTTGG
’
,
‘
GGAAACGAGCACGGTCGCGG
’
，
‘
TTTACCATTTCTTCCGTGTT
’
；(6)选定靶位点后，使用高保真酶对含有靶位点、tRNA和sgRNA片段进行PCR扩增；设计不同靶位点相应的引物，以包含tRNA和sgRNA序列的pGTR载体为模板；PCR扩增并进行胶回收获得～200bp的片段，然后取出PCR反应产物进行胶回收；(7)回收的目的片段使用BsaⅠ限制性内切酶和T4连接酶通过一步法连接反应连入PSK3
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CRISPR_2.0
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pRGEB31R骨架载体，连接反应产物转入DH5α，...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春祥，赵思怡，刘文文，赵海霞，刘敏，曹英萍，姜希萍，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：