一种甜荞FaesPDS基因VIGS体系及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种甜荞FaesPDS基因VIGS体系及其应用。本发明专利技术通过同源克隆，成功分离到3500bp的甜荞FaesPDS基因基因组DNA序列。选取甜荞FaesPDS基因组DNA中478bp的序列，构建pTRV2

【技术实现步骤摘要】
一种甜荞FaesPDS基因VIGS体系及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种甜荞FaesPDS基因VIGS体系及其应用。

技术介绍

[0002]甜荞(Fagopyrum esculentum moench.)是兼食、药、观赏和土壤修复等多用途于一体的经济作物，其籽粒不含谷蛋白，但富含芦丁、槲皮素多酚、多糖和赖氨等生物活性物质，近年作为重要的功能食品备受关注，市场前景广阔。同时甜荞因其生育期短、适应性广、抗性强，加之花色鲜艳可发展观光农业，是目前乡村种植业结构调控的特色作物之一，是助力乡村振兴的重要产业材料。然而，甜荞作为典型的二型花柱作物，其因二型花形成的异型自交不亲和(HSI)系统导致产量低，杂交育种困难，成为制约这一重要经济作物开发利用的瓶颈。与主要粮食作物相比，甜荞基因工程方面的研究相对滞后，该体系的建立和应用，对鉴定控制甜荞重要农艺性状基因的功能、甜荞雄性不育系的创制、开展甜荞分子育种和观食两用甜荞新品种培育等均有重要的借鉴意义。
[0003]病毒诱导的基因沉默VIGS(Virus
‑
induced gene silencing)是一种转录后基因沉默技术，目前已广泛应用于植物基因工程和基因功能鉴定的研究中，其原理是植物在抵御病毒侵染时会启动RNA沉默(RNA silencing)机制。烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)是目前应用较广泛，且效率和持久性好的病毒载体，其介导基因沉默同时不会引起病毒诱导的症状，改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用(Liu et al.,2002；Vel
á
squez et al.,2009)。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供一种甜荞FaesPDS基因VIGS体系及其应用。
[0005]首先，本专利技术提供一种甜荞FaesPDS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]其次，本专利技术提供一种用于VIGS的FaesPDS基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0007]本专利技术还提供一种构建所述甜荞FaesPDS基因VIGS体系的方法，包括扩增所述基因或其片度，克隆到烟草脆裂病毒(TRV)基因沉默表达载体pTRV2中。
[0008]本专利技术提供含有所述用于VIGS基因的FaesPDS基因片段的VIGS载体，宿主细胞和工程菌。
[0009]本专利技术还提供所述用于VIGS基因的FaesPDS基因或其片度、或者含有所述的用于VIGS基因的FaesPDS基因或其片度的VIGS载体在诱导甜荞叶片出现花叶性状中的用途。
[0010]在本专利技术一个具体实施方案中，将含有所述的用于VIGS基因的FaesPDS基因或其片度的VIGS载体与烟草脆裂病毒(TRV)的RNAi载体通过叶片注射法侵染甜荞幼叶，诱导甜荞FaesPDS基因出现VIGS。
[0011]本专利技术还提供一种诱导甜荞叶片出现花叶性状的方法，将含有所述的用于VIGS基因的FaesPDS基因或其片度的VIGS载体与烟草脆裂病毒(TRV)的RNAi载体通过叶片注射法侵染甜荞幼叶，诱导甜荞FaesPDS基因出现VIGS。
[0012]本专利技术首次通过成功构建甜荞FaesPDS基因VIGS体系，获得了具有能够使甜荞FaesPDS基因沉默的体系。通过叶片注射法侵染甜荞幼叶，皆出现不同程度的光漂白症状，后期通过qPCR检测FaesPDS基因的表达量，相比于对照，采用以上方法侵染后的甜荞FaesPDS基因表达量皆大幅度降低。甜荞光漂白症状的叶片提高了甜荞叶片的观赏价值，可丰富园林绿化、乡村荞麦花海营造中的景观元素，同时为观食两用的花叶甜荞新品种育积累基因资源。该体系的建立对控制甜荞重要农艺性状基因的功能鉴定有很重要的参考价值。
附图说明
[0013]图1所示是甜荞FaesPDS基因沉默载体转化农杆菌PCR检测。
[0014]图2所示是叶片注射法侵染烟草出现的光漂白表型图。(A)对照(pTRV2空载体)；(B)pTRV2
‑
FaesPDS侵染。
[0015]图3所示叶片注射法侵染绿叶白花同型长花柱甜荞出现的光漂白表型图。(A)对照(pTRV2空载体)；(B、C、D)pTRV2
‑
FaesPDS侵染。
[0016]图4所示为叶片注射法侵染紫叶红花同型长花柱甜荞出现光漂白表型图。(A)对照(pTRV2空载体)；(B、C、D)pTRV2
‑
FaesPDS侵染。
[0017]图5所示为实时荧光定量取材所用叶片。(A、B)绿叶白花同型长花柱甜荞出现的光漂白表型叶片；(CK1)绿叶白花同型长花柱甜荞对照(pTRV2空载体)；(C)为绿叶红花同型长花柱甜荞出现的光漂白表型叶片；(D)为紫叶红花同型长花柱甜荞出现的光漂白表型叶片；(CK2)紫叶红花同型长花柱甜荞对照(pTRV2空载体)。
[0018]图6所示为甜荞FaesPDS基因在图5对应植株中的相对表达量(小写字表示0.05水平的显著差异性)。
具体实施方式
[0019]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0020]实施例1克隆甜荞FaesPDS基因
[0021]根据NCBI中烟草和苦荞的PDS同源基因序列，在其保守区设计特异性引物(FaesPDS2
‑
F，FaesPDS2
‑
R)，以甜荞基因组DNA为模板，PCR扩增甜荞FaesPDS基因，电泳、目的片断胶回收、连接到pTOPO
‑
TA载体，转化到E.coli，在LB固体培养基(含有50μg/mL Amp
+
)筛选，挑取单克隆后PCR检测，将阳性克隆送样测序。
[0022]FaesPDS2
‑
F：TCGGTTGCAGTGGAAGGAACATTC；
[0023]FaesPDS2
‑
R：CAAAATCTTGGCCTTGCTCTGATC。
[0024]通过同源克隆，成功分离到3500bp的甜荞FaesPDS基因基因组DNA序列，序列如SEQ ID No.1所示。
[0025]实施例2
[0026]以甜荞FaesPDS基因组DNA序列为模版，选取其较为保守的区段的400
‑
500bp的DNA序列，设计引物(PDSVIGS
‑
F492，PDSVIGS
‑
R)，PCR扩增目的片断，电泳、胶回收，并将目的片断克隆到pTRV2载体上。
[0027]PDSVIGS
‑
F492：GTTACCGAATTCTCTAGAGGCTCAAGATGGATTGACT G；
[0028]PDS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甜荞FaesPDS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种用于VIGS的FaesPDS基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.一种构建权利要求1所述基因VIGS体系的方法，其特征在于，扩增权利要求1所述基因300
‑
500bp的片段，克隆到烟草脆裂病毒(TRV)基因沉默表达载体pTRV2中。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增片段至少包含权利要求2所述的基因片段。5.含有权利要求2所述的FaesPDS基因片段的VIGS载体。6.含有权利要求2所述基因或者...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志雄，李嘉谊，杨清玉，曾令天，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：