茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1及其编码产物和应用制造技术

本发明专利技术公开了茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1及其编码产物和应用，该基因具有SEQ ID No.1所示的DNA序列，编码具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的小分子量蛋白。研究发现该基因与植物的抗虫性密切相关，提高该基因的表达水平能够显著增强草本植物拟南芥和木本植物茶树对害虫的抗性。本发明专利技术为植物抗虫新品种选育以及有害生物绿色防控提供了基因资源及技术手段，具有潜在良好的应用前景和价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1及其编码产物和应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1及其编码产物和应用。

技术介绍

[0002]茶树是我国重要的多年生木本经济作物，而每年因茶树虫害造成的茶叶减产可达15％～20％，导致巨额经济损失。如茶园中最重要的害虫之一茶尺蠖(Ectropis obliqua)，其幼虫以茶树幼芽和成叶为食，大发生时可将茶树新梢、嫩茎、幼果和老叶全部吃光，部分茶区茶叶减产甚至高达60％以上。目前，施用化学农药依然是防治茶尺蠖的主要手段和措施，但农药对茶叶品质、生态系统和自然环境造成了恶劣影响。因此开发和利用茶树自身免疫系统以提高其对害虫的抗性是控制虫害和减少农药使用的理想选择。研究茶树抗虫相关基因的生物学功能，解析茶树虫害胁迫的分子机制，选育茶树抗虫新品种，将为抗虫基因工程研究提供科学依据，在农业生产上亦具有重要的实际应用价值。
[0003]蛋白酶抑制剂是一类对蛋白酶有抑制作用的多肽或蛋白质，天然而广泛存在于植物、动物和微生物中，通过调节机体内蛋白酶的活性从而参与调控生物体的多种生命进程。植物中的蛋白酶抑制剂含量丰富，约占总蛋白的1
‑
10％，主要存在于种子、块茎、子叶等贮藏器官内，一方面可水解外源蛋白酶，保护自身蛋白活性；另一方面可作为营养物质，为幼苗生长提供能量。而当植物叶片受到生物或非生物胁迫后植物蛋白酶抑制剂也会大量积累，作为直接防御化合物在植物应对逆境胁迫的防御反应中发挥着重要作用。根据所抑制蛋白酶的种类，植物蛋白酶抑制剂又可分为丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属羧肽酶抑制剂。其中SERPIN是最大的蛋白酶抑制剂超家族，其主要通过与植食性昆虫肠道内的蛋白酶竞争性结合，降低蛋白酶水解活性，影响昆虫消化功能，最终导致昆虫生长缓慢、发育不良甚至死亡。
[0004]近年来，已有研究表明通过转基因技术手段在烟草、拟南芥、棉花等植物中导入或增强SERPIN的表达能够显著提高植株对烟草天蛾、粘虫、棉铃虫等鳞翅目害虫的抗性，但在茶树中仍未见有关CsSERPIN基因的功能研究或应用。茶树作为多年生木本植物，传统的杂交、辐射诱变等育种方式存在周期长、效率低、操作复杂等诸多问题，且目前茶树仍不具备成熟完备的转基因技术体系。因此本专利技术涉及的茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1的抗虫功能研究和应用将为茶树抗虫品种的选育以及茶尺蠖的绿色防控提供宝贵的基因资源及技术手段。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于设计提供一种茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1及其编码产物和应用的技术方案。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术第一方面提供了一种茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1，其含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0008]本专利技术第二方面提供了一种上述的茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1编码的蛋白，其含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0009]本专利技术第三方面提供了一种含有上述的茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1的重组载体和重组菌。
[0010]本专利技术第四方面提供了茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1及其编码产物在提高植物抗虫性中的应用，所述茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0011]进一步，所述的应用，所述植物包括木本植物和草本植物。
[0012]本专利技术第五方面提供了茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1及其编码产物在提高植物抗虫性中的应用方法，该方法为将含有茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1的重组载体和重组菌导入植物中使植物过表达基因CsSERPIN1。
[0013]进一步，所述的应用方法，具体包括以下方式：
[0014](1)将所述重组农杆菌侵染拟南芥花絮，获得稳定遗传的CsSERPIN1过表达转基因拟南芥株系；
[0015](2)将所述重组农杆菌浸润茶树叶片，获得CsSERPIN1瞬时过表达茶树植株。
[0016]本专利技术的有益效果是，利用RT
‑
PCR和RACE技术首次分离并克隆了茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1，并通过同源和异源过表达实验首次验证了所述CsSERPIN1基因的生物学功能，证明其能够增强植物对害虫的抗性能力，为培育抗虫植物新品种以及害虫绿色防控提供宝贵的基因资源及技术手段，具有良好的潜在应用前景。
附图说明
[0017]图1为本专利技术CsSERPIN1基因全长的体外扩增产物凝胶电泳结果；
[0018]图2为本专利技术CsSERPIN1基因的过表达重组载体结构示意图；
[0019]图3为本专利技术CsSERPIN1基因在过表达植物中的表达水平检测图；其中，图3A为CsSERPIN1基因在拟南芥转基因株系AtOE
‑
2，AtOE
‑
5和AtOE
‑
8中的表达水平；图3B为CsSERPIN1基因在瞬时过表达茶树叶片CsOE中的表达水平；
[0020]图4为本专利技术CsSERPIN1过表达植物的抗虫性分析；其中图4A为转基因拟南芥的抗虫性分析；图4B为瞬时过表达茶树植株的抗虫性分析。
具体实施方式
[0021]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术范围。
[0022]下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
[0023]下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0024]实施例1、CsSERPIN1基因的获得和序列分析
[0025](1)提取茶树品种龙井43叶片的总RNA，经质量检测合格后反转录获得总cDNA第一链；
[0026](2)以总cDNA第一链为模板，利用上游引物(F:5
’‑
ACGCGTTTAGTATTGTGGCAC
‑3’
)和下游引物(R:5
’‑
CCTGGTGGGTTTCTAACATAAGC
‑3’
)组成的引物对对进行PCR扩增，获得CsSERPIN1基因片段；PCR扩增条件：98℃
×
4min
→
(98℃
×
40sec
→
60℃
×
40sec)
×
35循环
→
68℃
×
2min，得到特异PCR扩增产物条带如图1；
[0027](3)将获得的PCR产物连接到pEASY blunt zero载体上，得到CsSERPIN1
‑
zero；利用通用引物M13进行菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1，其特征在于，其含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。2.一种如权利要求1所述的茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1编码的蛋白，其特征在于，其含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。3.一种含有权利要求1所述的茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1的重组载体和重组菌。4.茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1及其编码产物在提高植物抗虫性中的应用，所述茶树丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CsSERPIN1含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：叶萌，何林彤，冯玲佳，刘传德，原晨虹，孙晓玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：