调控水稻籽粒重金属含量的基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了调控水稻籽粒重金属含量的基因及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种调控水稻籽粒重金属含量的RLC基因，所述RLC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术所述RLC基因在不同浓度的重金属镉胁迫处理条件下均能被诱导表达。本发明专利技术所述RLC基因在调控水稻籽粒中镉的积累过程中发挥了重要作用；同时不影响籽粒中的Mn含量。本发明专利技术可为培育低镉水稻提供一种有效方法，解决了低镉水稻遗传资源偏窄的问题。可以在不影响水稻产量的前提下，降低土壤Cd积累对于水稻植株以及籽粒的重金属污染问题。的重金属污染问题。的重金属污染问题。

【技术实现步骤摘要】
调控水稻籽粒重金属含量的基因及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及调控水稻籽粒重金属含量的基因及应用。

技术介绍

[0002]水稻作为世界上三大粮食作物之一，其总产量位于世界第二。据统计，世界上有超过50％的人口以稻米为主食
[1]。因此，如何让人们吃到更加优质、更加安全的稻米，是当今水稻育种工作的重要目标。镉(Cadmium，Cd)是人体非必需元素，其可以通过食物链在人体内富集，长期积累可导致骨质疏松症、肾功能障碍和癌症等多种疾病。随着工业化的快速发展以及化肥和农药的过度使用，土壤中不断增加的Cd污染已经严重威胁到粮食安全，增加了对人类健康的潜在风险
[2]。因此，研究植物吸收Cd的分子机理并筛选和培育耐Cd胁迫或低Cd累积的农作物，有益于人类健康和生态保护。
[0003]由于在植物中没有特定的Cd转运体，Cd通过广泛的阳离子转运系统被植物吸收。OsNRAMP5(resistance
‑
associatedmacrophage protein，NRAMP)是水稻植株锰(Mn，Manganese)和Cd的主要转运体，负责将Mn和Cd从外部溶液运输到根细胞中，其敲除系则失去了吸收Mn和Cd的能力
[3]。Mn是植物生长的必需元素，故后续研究水稻植株对于Cd的积累特性的同时，也应时刻关注植株及籽粒中Mn含量的变化。
[0004]金属伴侣蛋白通常是可溶性的细胞内蛋白，它与金属离子紧密结合，以防止与其他细胞元素发生有害反应，确保金属离子在细胞内安全地运输，在金属稳态和解毒过程中起着至关重要的作用
[4]。但目前对于金属伴侣蛋白RLC(LOC_Os04g39350)在水稻Cd胁迫下的功能还未有报道，是否可用于低镉水稻育种尚不清楚。
[0005]参考文献：
[0006]1.Sakamoto,T.&Matsuoka,M.Identifying and exploiting grain yield genes in rice.
[0007]Curr.Opin.PlantBiol.11,209
–
214(2008).
[0008]2.Kirkham,M.B.Cadmium in plants on polluted soils:Effects of soil factors,
[0009]hyperaccumulation,and amendments.Geoderma 137,19
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32(2006).
[0010]3.Sasaki,A.,Yamaji,N.,Yokosho,K.&Ma,J.F.Nramp5 Is a Major Transporter
[0011]Responsible for Manganese and Cadmium Uptake in Rice.Plant Cell 24,
[0012]2155
–
2167(2012).
[0013]4.Robinson,N.J.&Winge,D.R.Copper Metallochaperones.Annu.Rev.Biochem.
[0014]79,537
–
562(2010).

技术实现思路

[0015]本专利技术的目的在于提供调控水稻籽粒重金属含量的基因及应用，敲除RLC基因后可以显著降低籽粒中的Cd含量，而不影响籽粒中Mn含量。
[0016]本专利技术提供了一种调控水稻籽粒重金属含量的RLC基因，所述RLC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0017]优选的，所述重金属的种类包括镉。
[0018]本专利技术还提供了上述RLC基因在培育与镉含量相关水稻种质中的应用。
[0019]优选的，敲低所述RLC基因的表达或敲除所述RLC基因后水稻籽粒中镉含量降低。
[0020]本专利技术还提供了一种降低水稻籽粒中镉含量的方法，包括以下步骤：敲低所述RLC基因的表达或敲除上述RLC基因。
[0021]优选的，所述敲低或敲除的方法包括基因编辑。
[0022]优选的，当采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行所述敲低或敲除时，基因编辑靶点的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示和SEQ ID No.10所示。
[0023]本专利技术还提供了水稻RLC基因CRISPR
‑
cas9基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以pYLsgRNA
‑
OsU3载体为模板，分别利用第一引物对和第二引物对进行第一PCR扩增；以第一PCR扩增产物的混合物为模板，利用第三引物对进行第二PCR扩增；以第二PCR扩增产物为模板，利用第四引物对进行第三PCR扩增，得U3；所述第一引物对包括序列如SEQ ID No.6所示的U
‑
F和SEQ ID No.7所示的RLC
‑
OsU3T1 target；所述第二引物对包括序列如SEQ IDNo.8所示的RLC
‑
gRT1和SEQ ID No.9所示的gR
‑
R；所述第三引物对包括U
‑
F和gR
‑
R；所述第四引物对包括序列如SEQ ID No.12所示的Pps
‑
GGL和SEQ IDNo.13所示的Pgs
‑
GG2；
[0024](2)以pYLsgRNA
‑
OsU6a载体为模板，分别利用第五引物对和第六引物对进行第一PCR扩增；以以第一PCR扩增产物的混合物为模板，利用第三引物对进行第二PCR扩增；以第二PCR扩增产物为模板，利用第七引物对进行第三PCR扩增，得U6；所述第五引物对包括U
‑
F和序列为SEQ ID No.10所示的RLC
‑
OsU6aT2 target；所述第六引物对包括序列为SEQ ID No.11所示的RLC
‑
gRT2和gR
‑
R；所述第七引物对包括序列为SEQ ID No.14所示的Pps
‑
GG2和SEQ ID No.15所示的Pgs
‑
GGR；
[0025](3)将所述U3和U6分别利用BsaⅠ酶切后，进行连接，得RLC基因敲除双元载体；
[0026]步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后关系。
[0027]本专利技术还提供了利用上述构建方法得到的RLC基因敲除双元载体。
[0028]本专利技术还提供了一种培育低镉含量水稻种质的方法，包括以下步骤：将上述RLC基因敲除双元载体转化至水稻中，将得到的抗生素抗性愈伤组织进行组织分化，得到的RLC基因敲除转基因水稻材料为所述低镉含量水稻种质。
[0029]有益效果：本专利技术提供了一种调控水稻籽粒重金属含量的RLC基因，所述RLC基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控水稻籽粒重金属含量的RLC基因，其特征在于，所述RLC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述RLC基因，其特征在于，所述重金属的种类包括镉。3.权利要求1或2所述RLC基因在培育与镉含量相关水稻种质中的应用。4.根据权利要求4所述应用，其特征在于，敲低所述RLC基因的表达或敲除所述RLC基因后水稻籽粒中镉含量降低。5.一种降低水稻籽粒中镉含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：敲低所述RLC基因的表达或敲除权利要求1或2所述RLC基因。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述敲低或敲除的方法包括基因编辑。7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，当采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行所述敲低或敲除时，基因编辑靶点的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示和SEQ ID No.10所示。8.水稻RLC基因CRISPR
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cas9基因敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pYLsgRNA
‑
OsU3载体为模板，分别利用第一引物对和第二引物对进行第一PCR扩增；以第一PCR扩增产物的混合物为模板，利用第三引物对进行第二PCR扩增；以第二PCR扩增产物为模板，利用第四引物对进行第三PCR扩增，得U3；所述第一引物对包括序列如SEQ ID No.6所示的U
‑
F和SEQ ID No.7所示的RLC
‑
OsU3T1target；所述第二引物对包括序列如SEQ IDNo.8所示的RLC
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gRT1和SEQ ID No.9所示的gR

【专利技术属性】
技术研发人员：武亮，张雅琦，戎福喜，
申请(专利权)人：浙江大学海南研究院，
类型：发明
国别省市：