【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蔬菜品质性状分子标记开发和分子标记辅助育种，涉及南瓜果实长度快速筛选和分子标记辅助育种，具体涉及一种南瓜果实长度性状的kasp分子标记及其用途。
技术介绍
1、南瓜(cucurbita moschata duch)是一种重要的园艺作物。果实长度是南瓜重要的商品性状，不仅直接影响果实的大小与形状，也影响果实的商品品质和产量。由于不同的消费者对果实形状、大小的偏好不同，培育不同果型的南瓜新品种对育种工作来说具有重大意义。因此，阐明南瓜果实长度和形态建成的遗传规律、定位南瓜果实长度相关功能基因是提高南瓜产量和商品品质的重要基础。
2、果实长度和形状的变化受到多种因素的影响，是一个有多个数量性状遗传位点、激素和环境因子共同调控的复杂过程（liu jp, van eck j, cong b, tanksley sd(2002) a new class of regulatory genes underlying the cause of pear-shapedtomato fruit. proceedings of the national academy of sciences of the unitedstates of america 99:13302-13306）。许多调控果实长度的重要基因和qtls已经在一些园艺作物中被报道。在番茄中，ovate 和 sun被报道调控果实伸长。在辣椒、茄子、黄瓜、西瓜等园艺作物中，也定位到了这两个基因的直系同源基因或同基因家族成员，影响相关物种的果实长度。然而，到目前为
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一个南瓜果实长度性状的kasp分子标记及其用途；所述kasp分子标记cmofl (fruit length)与南瓜果实长度性状紧密连锁，该分子标记能用于鉴定筛选不同南瓜果实长度材料及其后代的辅助选择育种。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种基于bsa混池测序定位的南瓜果实长度性状基因设计的用于鉴定不同南瓜果实长度的kasp分子标记；
3、所述kasp分子标记为snp标记，位于南瓜14号染色体的815954 bp处；分子标记对应的扩增序列如seq id no.1所示：
4、aacccacattaaccctttcatttcatataaatatttgagaatttagctctngaaaaagaaaaagatttaatttaacattt
5、其中下划线对应的n是snp位点，n的基因型是t/g，t基因型对应的表型为长果，g基因型对应的表型为短果。
6、本专利技术的第二方面，还提供了用于检测南瓜果实长度性状的kasp分子标记cmofl的引物组合，引物组合包括：
7、正向引物f1：
8、5’- gaaggtgaccaagttcatgctaaatgttaaattaaatctttttctttttca-3’
9、正向引物f2：
10、5’- gaaggtgaccaagttcatgctaaatgttaaattaaatctttttctttttcc-3’
11、反向引物r：
12、5’- aacccacattaaccctttca-3’。
13、本专利技术的第三方面，还同时提供了上述分子标记的用途，用于鉴定南瓜果实长度，辅助不同南瓜果实长度材料或其后代的选择育种。
14、在一个具体的实施案例中，具体为：
15、（1）提取待测南瓜样本的基因组dna；
16、（2）利用引物组合对获得的基因组 dna 进行 pcr 扩增；
17、（3）检测pcr扩增结果的荧光信号判断待测南瓜的果实长度。其中，若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f1的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合tt基因型，表型为长果；若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f2的荧光接头颜色一致，则待测南瓜为纯合gg基因型，表型为短果。
18、本专利技术的第四方面，还提供了南瓜中果实长度性状连锁的单核苷酸多态性鉴定方法，包括以下步骤：
19、(1) 以长果南瓜材料kg1和短果南瓜材料mbf为亲本进行杂交，然后自交，构建遗传分离群体f2，从而获得不同果实长度分离的f2单株；
20、(2) 用ctab(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取南瓜亲本幼苗及杂交后代f2群体幼苗基因组dna；
21、(3) 采用bsa(分离群体分析，bulked segregant analysis)定位与南瓜果实长度性状相关的区域或基因。
22、(4) 鉴定与南瓜果实长度性状紧密连锁的单核苷酸多态性序列。
23、本专利技术的第五方面，还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：
24、(1) 以长果南瓜材料kg1和短果南瓜材料mbf为亲本进行杂交，然后自交，从而获得不同果实长度分离的f2群体；
25、(2) 用ctab(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取南瓜亲本幼苗及杂交后代f2群体幼苗基因组dna；
26、(3) 挑选f2群体中极端果实长度材料构建长果、短果混池，采用bsa(分离群体分析，bulked segregant analysis)定位与南瓜果实长度性状相关的区域。
27、(4) 鉴定与南瓜果实长度性状紧密连锁的snp变异和indel插入缺失变异。
28、(5) 基于连锁的变异，采用kasp (竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，kompetitive allele specific polymerase chain reaction)方法进行南瓜果实长度性状分子标记的筛选；
29、(6) 开发出一个与南瓜果实长度性状紧密连锁的kasp分子标记cmofl，kasp分子标记引物组合由正向引物f1、f2和反向引物r组成。引物组合可委托上海生工生物工程股份有限公司合成，在abi step one pcr仪上进行扩增。
30、本专利技术的第五方面，还提供一种鉴定南瓜果实长度的方法，具体是：
31、（1）提取待测南瓜样本的基因组dna；
32、（2）利用所述的引物组合对获得的基因组dna进行pcr扩增；
33、（3）检测pcr扩增结果的荧光信号判断待测南瓜的果实长度。其中，若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f1的荧光接头本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一个南瓜果实长度性状的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记为SNP标记，位于南瓜14号染色体的815954 bp处；KASP分子标记对应的扩增序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种检测南瓜果实长度性状的KASP分子标记的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：
3.一种权利要求1所述南瓜果实长度性状的KASP分子标记或权利要求2所述检测南瓜果实长度性状的KASP分子标记的引物组合在鉴定南瓜果实长度中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，具体为：
5.一种鉴定南瓜果实长度的方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增采用的PCR反应体系为：20-50 ng/μl南瓜基因组DNA 5.0 μl，KASP Master Mix 5.0 μl，KASP AssayMix0.14 μl，总体积为10.14 μl；所述KASP Master Mix 5.0 μl，KASP Assay Mix中，正向引物F1：正向引物F2：反向引物R的体积比为2
...【技术特征摘要】
1.一个南瓜果实长度性状的kasp分子标记，其特征在于，所述kasp分子标记为snp标记，位于南瓜14号染色体的815954 bp处；kasp分子标记对应的扩增序列如seq id no.1所示。
2.一种检测南瓜果实长度性状的kasp分子标记的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：
3.一种权利要求1所述南瓜果实长度性状的kasp分子标记或权利要求2所述检测南瓜果实长度性状的kasp分子标记的引物组合在鉴定南瓜果实长度中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，具体为...
【专利技术属性】
技术研发人员：张明方，吕小龙，周艺梅，赵萌，杨景华，胡仲远，
申请(专利权)人：浙江大学海南研究院，
类型：发明
国别省市：
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