绿原酸抑制LPS诱导的RAW264．7细胞炎症方法技术

本发明专利技术公开了一种绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法，它涉及细胞炎症抑制技术领域。以CCK

【技术实现步骤摘要】
绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法


[0001]本专利技术涉及的是细胞炎症抑制
，具体涉及绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法。

技术介绍

[0002]近年来，部分地区抗生素使用不规范，加之抗生素的应用与多重耐药和泛耐药细菌的传播之间存在时间差，导致抗生素耐药性逐年升高，临床耐药愈发严峻。其中，耐药菌感染所致肺炎主要表现为获得性肺炎，在临床获得性感染疾病中占第一位，其治疗因耐药菌的存在有一定难度，导致患者住院时间延长，病死率明显升高，给患者和社会带来了沉重的医疗经济负担。
[0003]中医药治疗耐药菌感染因不易引起耐药而备受关注，耐药菌属风热之邪，侵袭机体首先犯肺，其所致肺炎核心病机为正气不足，邪毒内伏。芪归银方由黄芪、当归、金银花、青蒿和虎杖五味药合理配伍而成，为扶正透邪治则经典方，契合耐药菌所致肺炎病机，且前期研究已证实芪归银方治疗耐药菌所致肺炎临床疗效肯定。绿原酸为芪归银方中金银花和青蒿共同药理成分且在芪归银方中含量较高，此外，在动物模型中绿原酸已被证明可以减少炎症并调节炎症和神经性疼痛。
[0004]在机体免疫应答的诸多细胞中，巨噬细胞以其对非特异免疫应答不可替代的作用而受到广泛关注。在炎性疾病中，巨噬细胞在病程的不同阶段表型发生相应的改变，以维持、加剧或者抑制、终止炎症反应。基于此，开发一种绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法尤为必要。

技术实现思路

[0005]针对现有技术上存在的不足，本专利技术目的是在于提供一种绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法，操作简便，抑制炎症因子的表达，发挥抗炎作用，为耐药菌所致肺炎的中医药防治提供可能的治疗策略，易于推广使用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法，其步骤为：
[0007](1)以CCK
‑
8法检测不同浓度绿原酸干预后RAW264.7的细胞活力；
[0008](2)采用LPS刺激小鼠巨噬细胞，预制细胞炎症状态，设置空白对照组(K)、模型对照组(L)和实验组(S)，分别给药，动态观察细胞形态；
[0009](3)分别于24h、48h获取细胞沉淀及上清，以酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清中炎症因子白介素
‑
1β(IL
‑
1β)、单核细胞趋化蛋白
‑
1(MCP
‑
1)及精氨酸酶
‑
1(Arg
‑
1)的浓度；
[0010](4)采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、转化生长因子1(TGFβ1)、高迁移率组蛋白1(HMGB1)及核转录因子
‑
κB(NF
‑
κB)的mRNA表达。
[0011]作为优选，所述的步骤(1)将处于对数生长期的RAW462.7细胞姐终于96孔板，设置
校正组、空白对照组(K)、不同浓度绿原酸组：校正组中只含有等体积不含FBS的DMEM；空白对照组(K)中含细胞及不含FBS的DMEM；绿原酸组中含细胞及不同浓度的绿原酸；每组3个复孔，于恒温培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h；检测前2h每孔加入10％的CCK
‑
8溶液，避光孵育2h，酶标仪450nm处检测吸光度值OD
450
。
[0012]作为优选，所述的绿原酸组的梯度浓度依次分别为12.5、25、50、100、200ug/mL。
[0013]作为优选，所述的步骤(2)中巨噬细胞以含15％FBS的DMEM进行复苏，于恒温培养箱(37℃，5％CO2)中培养，倒置显微镜下动态监测细胞生长情况；1
‑
2d传代，生长密度达到85％以上后，按1：2或1：3以含10％FBS的DMEM进行传代，取对数生长期的细胞用于实验；将处于对数生长期的细胞接种于6孔板(5
×
105/mL，每孔2mL)，孵育12h，饥饿后，分三组进行处理：
[0014]①
空白对照组(K)，加入同等体积的不含FBS的DMEM；
[0015]②
模型对照组(L)，以LPS刺激RAW264.7，使LPS终浓度达到1ug/mL；
[0016]③
实验组(S)，以LPS刺激RAW264.7，使LPS终浓度达到1ug/mL，加入以不含FBS的DMEM为溶剂的绿原酸，使绿原酸终浓度达到50ug/mL。
[0017]作为优选，所述的步骤(3)按照步骤(2)的分组，于培养24h、48h后获取上清及沉淀；根据ELISA试剂盒说明书操作，检测各组上清中IL
‑
1β、Arg
‑
1及MCP
‑
1的含量，绘ELISA标准曲线，依据曲线公式，结合稀释倍数求得样本各指标的含量。
[0018]作为优选，所述的步骤(4)采用TRIzol直接裂解法提取细胞总RNA，定量PCR仪检测RNA纯度和浓度，按照逆转录试剂盒Thermo First cDNA Synthesis Kit及miRNA逆转录试剂盒说明书反转录为相应cDNA，后按照说明书加样于荧光定量PCR仪中进行扩增和检测；每次扩增以Actin为内参，采用相对定量法对PCR产物进行分析，2
‑△△
Ct法分析基因表达。
[0019]本专利技术的有益效果：本专利技术以LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7损伤，研究绿原酸对RAW264.7细胞炎症的抑制作用，操作简便，抑制炎症因子的表达，发挥抗炎作用，为耐药菌所致肺炎的中医药防治提供可能的治疗策略，应用前景广阔。
附图说明
[0020]下面结合附图和具体实施方式来详细说明本专利技术；
[0021]图1为本专利技术不同浓度绿原酸预处理后RAW264.7的细胞存活率示意图；
[0022]图2为本专利技术不同干预方式及时间点RAW264.7的细胞形态示意图；
[0023]图3为本专利技术LPS诱导的RAW264.7细胞NF
‑
κB、TGFβ1及HMGB1的mRNA水平示意图；
[0024]图4为本专利技术细胞上清中IL
‑
1β、MCP
‑
1及Arg
‑
1的含量示意图；
[0025]图5为本专利技术绿原酸抑制LPS诱导RAW264.7的NF
‑
κB、HMGB1、PTGS2及TGFβ1的mRNA水平示意图。
具体实施方式
[0026]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。
[0027]参照图1
‑
5，本具体实施方式采用以下技术方案：绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法，其步骤为：
[0028](1)以CCK
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法，其特征在于，其步骤为：(1)以CCK
‑
8法检测不同浓度绿原酸干预后RAW264.7的细胞活力；(2)采用LPS刺激小鼠巨噬细胞，预制细胞炎症状态，设置空白对照组(K)、模型对照组(L)和实验组(S)，分别给药，动态观察细胞形态；(3)分别于24 h、48 h获取细胞沉淀及上清，以酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清中炎症因子白介素
‑
1β(IL
‑
1β)、单核细胞趋化蛋白
‑
1(MCP
‑
1)及精氨酸酶
‑
1(Arg
‑
1)的浓度；(4)采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、转化生长因子1(TGFβ1)、高迁移率组蛋白1(HMGB1)及核转录因子
‑
κB(NF
‑
κB)的mRNA表达。2.根据权利要求1所述的绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法，其特征在于，所述的步骤(1)将处于对数生长期的RAW462.7细胞姐终于96孔板，设置校正组、空白对照组(K)、不同浓度绿原酸组：校正组中只含有等体积不含FBS的DMEM；空白对照组(K)中含细胞及不含FBS的DMEM；绿原酸组中含细胞及不同浓度的绿原酸；每组3个复孔，于恒温培养箱中(37 ℃，5% CO2)培养24 h；检测前2h每孔加入10%的CCK
‑
8溶液，避光孵育2h，酶标仪450 nm处检测吸光度。3.根据权利要求2所述的绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法，其特征在于，所述的绿原酸组的梯度浓度依次分别为12.5、25、50、100、200 ug/mL。4.根据权利要求1所述的绿原酸抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁军颖，周云鑫，刘清泉，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京中医医院，
类型：发明
国别省市：