乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白氨基酸序列及制备方法技术

本申请实施例属于病毒学与免疫学技术领域，涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白氨基酸序列及制备方法，包括将获取的乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列转化为乙型肝炎病毒表面抗原碱基序列，通过毕赤酵母密码子优化乙型肝炎病毒表面抗原碱基序列，得到优化碱基序列；在pPinkα

【技术实现步骤摘要】
乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白氨基酸序列及制备方法


[0001]本申请涉及病毒学与免疫学
，更具体地，涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白氨基酸序列及制备方法。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由S基因编码，属于乙型肝炎病毒(HBV)包膜的主要蛋白质，大量存在于感染者的血液中，是HBV感染的主要指标。HBsAg是乙肝疫苗的主要成分，能够诱导机体产生保护性抗体乙肝表面抗体。
[0003]HBsAg在大肠杆菌中的表达产物不稳定易降解，缺少翻译后修饰，免疫原性差。
[0004]CHO细胞表达的HBsAg更接近天然状态，翻译后的蛋白增加了糖基化修饰，免疫原性良好且抗体维持时间长，同时具有良好的产品稳定性，但产量低、成本高是目前遇到的主要问题(张艳.HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究.吉林大学，2008.)。通常在CHO细胞染色体上存在15,000个外源基因整合位点，其中仅有15个左右可产生高水平表达，理论上需筛选约1,000个细胞克隆才可能得到1个真正高表达的细胞株。进行传代扩增后，细胞在遗传学上容易发生较大的改变，因此，筛选适宜生产的高表达细胞株需要大量的时间和工作(时成波,徐军,王堃,贾重来,徐冬冬,盛军.高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建[J].中国生物制品学杂志,2009,22(12):1172
‑
1175.)。

技术实现思路

[0005]本申请实施例所要解决的技术问题是相关技术中蛋白质在大肠杆菌中异源表达时，容易被降解，不稳定，而且表达出来的蛋白质缺乏翻译后修饰，导致生物学活性降低或丧失，以及高表达细胞株生产成本高的问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白氨基酸序列，所述重组蛋白氨基酸序列为：
[0007]MGGWSSKPRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVGAGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTVPAAPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPNMENTTGGGGSGGGGSGGGGSPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRGGGGSGGGGSGGGGSDYQGMLPVCPLLPGTSTTTTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVR。
[0008]为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种乙型肝炎病毒表面抗原的制备方法，采用了如下所述的技术方案：
[0009]获取乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列，将所述乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列转化为乙型肝炎病毒表面抗原碱基序列，通过毕赤酵母密码子优化所述乙型肝炎病毒表面抗原碱基序列，得到优化碱基序列；
[0010]在所述乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列的N端融合多聚组氨酸标签HisTag，并以pPinkα
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HC为载体、以Stu I和Swa I为酶切位点，插入所述优化碱基序列，得到构建的原
始重组质粒；
[0011]对所述重组质粒进行转化大肠杆菌，生成质粒转化单菌，挑取所述质粒转化单菌扩增培养，得到扩增培养物，从所述扩增培养物中抽提重组质粒；
[0012]线性化处理所述重组质粒，得到线性化质粒；
[0013]将所述线性化质粒转入毕赤酵母感受态细胞，培养得到质粒单菌，从所述质粒单菌中筛选出分泌表达乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白的阳性菌株；
[0014]对所述阳性菌株进行扩大培养以及甲醇诱导表达，得到发酵液上清，纯化所述发酵液上清得到乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白；
[0015]将所述乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白氨基酸序列作为所述乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列，制得所述乙型肝炎病毒表面抗原。
[0016]进一步的，在所述纯化所述发酵上清液得到乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白的步骤之后还包括：
[0017]选出符合预设蛋白条件的乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白作为目的蛋白；
[0018]对所述目的蛋白进行免疫学活性鉴定，将符合预设免疫学活性条件的所述目的蛋白作为乙型肝炎病毒表面抗原。
[0019]进一步的，所述对所述目的蛋白进行免疫学活性鉴定采用如下步骤进行：
[0020]使用包被缓冲液将乙型肝炎病毒表面抗原稀释至预设浓度，混匀，得到包被液，将所述包被液加入酶标板中；
[0021]使用洗板机以及预配制的洗涤缓冲液，对所述酶标板进行洗涤；
[0022]往所述酶标板中加入DSM封闭液，并在恒温培养箱中进行孵育；
[0023]用PBS缓冲液将所述目的蛋白按规定稀释相应倍数，得到待测样品溶液；
[0024]使用洗板机以及预配制的洗涤缓冲液，对孵育后的所述酶标板进行洗涤，并进行干燥；
[0025]往所述酶标板中加入待测样品溶液，进行恒温孵育；
[0026]使用洗板机以及预配制的洗涤缓冲液，对恒温孵育后的所述酶标板进行洗涤，并进行干燥；
[0027]往所述酶标板中加入预配制的酶标抗体溶液，进行恒温孵育；
[0028]使用洗板机以及预配制的洗涤缓冲液，对恒温孵育后的所述酶标板进行洗涤，并进行干燥；
[0029]将预配制的TMB显色液加入所述酶标板中，室温避光显色至肉眼可见浅蓝色；
[0030]按照添加所述TMB显色液的顺序，往所述酶标板加入硫酸，轻振酶标板，使终止反应完全；
[0031]在酶标仪上450nm/630nm测OD值，得到免疫学活性检测结果。
[0032]进一步的，所述对所述原始重组质粒进行转化大肠杆菌，生成质粒转化单菌，挑取所述质粒转化单菌进行扩增培养，得到扩增培养物的步骤包括：
[0033]取出所述原始重组质粒，通过化学转化法转化大肠杆菌感受态细胞，得到质粒转化菌液；
[0034]取所述质粒转化菌液涂布于氨苄抗性平板上，恒温倒置过夜培养，生成质粒转化单菌；
[0035]取2支试管，各加入LB培养基，再加入氨苄抗生素；
[0036]从所述氨苄抗性平板上挑取所述质粒转化单菌，接种到试管中，并进行震荡培养，得到扩增培养物。
[0037]进一步的，所述将所述线性化质粒转入毕赤酵母感受态细胞，培养得到质粒单菌的步骤包括：
[0038]制备所述毕赤酵母感受态细胞；
[0039]将所述感受态细胞和所述线性化质粒进行混合，得到电击混合物；
[0040]将所述电击混合物进行电转化，得到电转化产物，培养所述电转化产物，得到质粒培养物；
[0041]将所述质粒培养物涂布到选择平板上进行培养，长出质粒单菌。
[0042]进一步的，所述制备所述毕赤酵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白氨基酸序列，其特征在于，所述重组蛋白氨基酸序列为：MGGWSSKPRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQVGAGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTVPAAPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPNMENTTGGGGSGGGGSGGGGSPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRGGGGSGGGGSGGGGSDYQGMLPVCPLLPGTSTTTTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVR。2.一种乙型肝炎病毒表面抗原的制备方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒表面抗原采用如权利要求1所述的重组蛋白氨基酸序列制得，包括：获取乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列，将所述乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列转化为乙型肝炎病毒表面抗原碱基序列，通过毕赤酵母密码子优化所述乙型肝炎病毒表面抗原碱基序列，得到优化碱基序列；在所述乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列的N端融合多聚组氨酸标签HisTag，并以pPinkα
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HC为载体、以Stu I和Swa I为酶切位点，插入所述优化碱基序列，得到构建的原始重组质粒；对所述原始重组质粒进行转化大肠杆菌，生成质粒转化单菌，挑取所述质粒转化单菌扩增培养，得到扩增培养物，从所述扩增培养物中抽提重组质粒；线性化处理所述重组质粒，得到线性化质粒；将所述线性化质粒转入毕赤酵母感受态细胞，培养得到质粒单菌，从所述质粒单菌中筛选出分泌表达乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白的阳性菌株；对所述阳性菌株进行扩大培养以及甲醇诱导表达，得到发酵液上清，纯化所述发酵液上清得到乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白；将所述乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白氨基酸序列作为所述乙型肝炎病毒表面抗原氨基酸序列，制得所述乙型肝炎病毒表面抗原。3.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒表面抗原的制备方法，其特征在于，在所述纯化所述发酵上清液得到乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白的步骤之后还包括：选出符合预设蛋白条件的乙型肝炎病毒表面抗原重组蛋白作为目的蛋白；对所述目的蛋白进行免疫学活性鉴定，将符合预设免疫学活性条件的所述目的蛋白作为乙型肝炎病毒表面抗原。4.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒表面抗原的制备方法，其特征在于，所述对所述目的蛋白进行免疫学活性鉴定采用如下步骤进行：使用包被缓冲液将乙型肝炎病毒表面抗原稀释至预设浓度，混匀，得到包被液，将所述包被液加入酶标板中；使用洗板机以及预配制的洗涤缓冲液，对所述酶标板进行洗涤；往所述酶标板中加入DSM封闭液，并在恒温培养箱中进行孵育；用PBS缓冲液将所述目的蛋白按规定稀释相应倍数，得到待测样品溶液；使用洗板机以及预配制的洗涤缓冲液，对孵育后的所述酶标板进行洗涤，并进行干燥；往所述酶标板中加入待测样品溶液，进行恒温孵育；使用洗板机以及预配制的洗涤缓冲液，对恒温孵育后的所述酶标板进行洗涤，并进行
干燥；往所述酶标板中加入预配制的酶标抗体溶液，进行恒温孵育；使用洗板机以及预配制的洗涤缓冲液，对恒温孵育后的所述酶标板进行洗涤，并进行干燥；将预配制的TMB显色液加入所述酶标板中，室温避光显色至肉眼可见浅蓝色；按照添加所述TMB显色液的顺序，往所述酶标板加入硫酸，轻振酶标板，使终止反应完全；在酶标仪上450nm/630nm测OD值，得到免疫学活性检测结果。5.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒表面抗原的制备方法，其特征在于，所述对所述原始重组质粒进行转化大肠杆菌，生成质粒转化单菌，挑取所述质粒转化单菌进行扩增培养，得到扩增培养物的步骤包括：取出所述原始重组质粒，通过化学转化法转化大肠杆菌感受态细胞，得到质粒转化菌液；取所述质粒转化菌液涂布于氨苄抗性平板上，恒温倒置过夜培养，生成质粒转化单菌；取2支试管，各加入LB培养基，再加入氨苄抗生素；从所述氨苄抗性平板上挑取所述质粒转化单菌，接种到试管中，并进行震荡培养，得到扩增培养物。6.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒表面抗原的制备方法，其特征在于，所述将所述线性化质粒转入毕赤酵母感受态细胞，培养得到质粒单菌的步骤包括：制备所述毕赤酵母感受态细胞；将所述感受态细胞和所述线性化质粒进行混合，得到电击混合物；将所述电击混合物进行电转化，得到电转化产物，培养所述电转...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄黉，蒋析文，巩路，朱伟伟，何祖强，黄昌顺，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：