一种乙型肝炎病毒e抗原制备方法技术

本申请实施例属于病毒学与免疫学技术领域，涉及一种乙型肝炎病毒e抗原制备方法，包括将获取的HBeAg氨基酸序列转化为HBeAg碱基序列，通过毕赤酵母密码子优化HBeAg碱基序列，得到优化后的目的基因；插入到pPinkα

【技术实现步骤摘要】
一种乙型肝炎病毒e抗原制备方法


[0001]本申请涉及病毒学与免疫学
，更具体地，涉及一种乙型肝炎病毒e抗原制备方法。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是由C基因编码，是preC蛋白翻译后加工的产物。20世纪80年代我国开始采用放射免疫和ELISA等方法检测HBeAg，最初是在HBV感染者血清中获取HBeAg作为检测抗原，具有优良的特异性和免疫原性，但其纯化工艺复杂、不易获得、稳定性差且存在生物安全隐患。
[0003]其次，HBeAg和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)均由HBV的ORF
‑
C编码，大约有75％的序列一致性，却具有完全不同的B细胞表位，即拥有能够被B细胞受体和特异性抗体分子识别的抗原决定簇。据报道，HBeAg特异性的高低取决于宿主细胞蛋白表达后的正确折叠，可以形成构象表位，由于原核表达系统缺乏翻译后修饰等功能，难以有效模拟其母本蛋白，在使用大肠杆菌表达HBeAg时，不能消除HBcAg的线性表位，使二者存在明显的交叉抗原性，严重影响HBeAg对抗HBe的检测。

技术实现思路

[0004]本申请实施例所要解决的技术问题是相关技术中生产得到的HBeAg生物学活性低、稳定性差，同时，HBeAg在原核表达系统中与HBcAg存在明显的交叉抗原性，严重影响HBeAg的特异性和灵敏性的问题。
[0005]为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种乙型肝炎病毒e抗原制备方法，采用了如下所述的技术方案：
[0006]获取HBeAg氨基酸序列，将所述HBeAg氨基酸序列转化为HBeAg碱基序列，通过毕赤酵母密码子优化HBeAg碱基序列，得到优化后的HBeAg碱基序列作为目的基因；
[0007]在所述HBeAg氨基酸序列的N端融合多聚组氨酸标签HisTag，并以pPinkα
‑
HC为载体、以Stu I和Swa I为酶切位点，插入所述目的基因，构建出重组质粒；
[0008]将所述重组质粒转入大肠杆菌，进行扩增培养，得到扩增培养物；
[0009]从所述扩增培养物中提取出所述重组质粒进行线性化处理，得到线性化质粒；
[0010]将所述线性化质粒转入毕赤酵母，得到质粒转化毕赤酵母，对所述质粒转化毕赤酵母进行培养，获得阳性酵母单菌；
[0011]对所述阳性酵母单菌进行培养、诱导表达，获得发酵液，对所述发酵液进行蛋白纯化，得到乙型肝炎病毒e抗原重组蛋白；
[0012]选出符合预设蛋白条件的乙型肝炎病毒e抗原重组蛋白作为目的蛋白；
[0013]对所述目的蛋白进行免疫学活性鉴定，将符合预设免疫学活性条件的所述目的蛋白作为乙型肝炎病毒e抗原；
[0014]其中，所述目的基因的碱基序列为：
[0015]TTGATTATTTCTTGTTCTTGTCCAACTGTTCAAGCTTCTAAATTGTGTTTGGGTTGGTTGTGGGGTATGGATATTGATCCATATAAAGAATTTGGTGCTTCTGTTGAATTGTTGTCTTTTTTGCCATCTGATTTTTTTCCATCTATTAGAGATTTGTTGGATACTGCTTCTGCTTTGTATAGAGAAGCTTTGGAATCTCCTGAACATTGTTCTCCACATCATACTGCTTTGAGACAAGCTATTTTGTGTTGGGGTGAATTGATGAATTTGGCTACTTGGGTTGGTTCTAATTTGGAAGATCCTGCTTCTAGAGAATTGGTTGTTTCTTATGTTAATGTCAACACTGGATTGAAAATTAGGCAATTGTTGTGGTTTCATATTTCTTGTTTGACTTTTGGTAGAGAAACTGTTTTGGAATATTTGGTTTCTTTTGGTGTTTGGATTAGAACTCCACCTGCTTATAGACCACAAAAT；
[0016]所述乙型肝炎病毒e抗原重组蛋白的氨基酸序列为：
[0017]LIISCSCPTVQASKLCLGWLWGMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNTGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQN。
[0018]进一步的，所述将所述重组质粒转化大肠杆菌进行扩增培养，得到扩增培养物的步骤包括：
[0019]取出所述重组质粒，通过化学转化法转化大肠杆菌感受态细胞，得到质粒转化菌液；
[0020]取所述质粒转化菌液涂布于氨苄抗性平板上，恒温倒置过夜培养，生成质粒转化单菌；
[0021]取2支试管，各加入LB培养基，再加入氨苄抗生素；
[0022]从所述氨苄抗性平板上挑取所述质粒转化单菌，接种到试管中，震荡培养至LB培养基出现明显浑浊，得到扩增培养物。
[0023]进一步的，所述从所述扩增培养物中提取出所述重组质粒进行线性化处理，得到线性化质粒的步骤包括：
[0024]使用质粒小量抽提试剂盒从所述扩增培养物中提取所述重组质粒；
[0025]通过限制性内切酶在TRP2区对所述重组质粒进行切割，得到线性化质粒。
[0026]进一步的，所述将所述线性化质粒转入毕赤酵母，得到质粒转化毕赤酵母，对所述质粒转化毕赤酵母进行培养，获得阳性酵母单菌的步骤包括：
[0027]制备所述毕赤酵母感受态细胞；
[0028]将所述感受态细胞和所述线性化质粒进行混合，得到混合产物；
[0029]将所述混合产物进行电转化后，得到质粒转化毕赤酵母，并培养所述质粒转化毕赤酵母，得到质粒转化酵母培养物；
[0030]将所述质粒转化酵母培养物涂布到选择平板上进行培养，培养出阳性酵母单菌。
[0031]进一步的，所述制备所述毕赤酵母感受态细胞的步骤包括：
[0032]取甘油管菌划线于第一YPD培养基中培养，长出单菌；
[0033]挑取单菌落接种于第二YPD培养基中进行培养；
[0034]转接到装有YPD的三角瓶中进行培养，得到菌体培养物；
[0035]将所述菌体培养物转移到离心管中离心，并用预冷的无菌水重悬菌体培养物；
[0036]离心重悬后的菌体培养物，弃去上清液，保留第一沉淀，并用预冷的无菌水重悬第一沉淀，得到第一溶液；
[0037]离心第一溶液，弃去上清液后，保留第二沉淀，并用预冷的1M山梨醇重悬第二沉
淀，得到第二溶液，冰浴；
[0038]离心第二溶液，弃去上清液后，用预冷的山梨醇重悬至预设体积，得到毕赤酵母感受态细胞。
[0039]进一步的，所述将所述混合产物进行电转化后，得到质粒转化毕赤酵母，并培养所述质粒转化毕赤酵母，得到质粒转化酵母培养物的步骤包括：
[0040]将所述混合产物加入到预冷的电转化杯中；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒e抗原制备方法，其特征在于，包括：获取HBeAg氨基酸序列，将所述HBeAg氨基酸序列转化为HBeAg碱基序列，通过毕赤酵母密码子优化HBeAg碱基序列，得到优化后的HBeAg碱基序列作为目的基因；在所述HBeAg氨基酸序列的N端融合多聚组氨酸标签HisTag，并以pPinkα
‑
HC为载体、以Stu I和Swa I为酶切位点，插入所述目的基因，构建出重组质粒；将所述重组质粒转化大肠杆菌进行扩增培养，得到扩增培养物；从所述扩增培养物中提取出所述重组质粒进行线性化处理，得到线性化质粒；将所述线性化质粒转入毕赤酵母，得到质粒转化毕赤酵母，对所述质粒转化毕赤酵母进行培养，获得阳性酵母单菌；对所述阳性酵母单菌进行培养、诱导表达，获得发酵液，对所述发酵液进行蛋白纯化，得到乙型肝炎病毒e抗原重组蛋白；选出符合预设蛋白条件的乙型肝炎病毒e抗原重组蛋白作为目的蛋白；对所述目的蛋白进行免疫学活性鉴定，将符合预设免疫学活性条件的所述目的蛋白作为乙型肝炎病毒e抗原；其中，所述目的基因的碱基序列为：TTGATTATTTCTTGTTCTTGTCCAACTGTTCAAGCTTCTAAATTGTGTTTGGGTTGGTTGTGGGGTATGGATATTGATCCATATAAAGAATTTGGTGCTTCTGTTGAATTGTTGTCTTTTTTGCCATCTGATTTTTTTCCATCTATTAGAGATTTGTTGGATACTGCTTCTGCTTTGTATAGAGAAGCTTTGGAATCTCCTGAACATTGTTCTCCACATCATACTGCTTTGAGACAAGCTATTTTGTGTTGGGGTGAATTGATGAATTTGGCTACTTGGGTTGGTTCTAATTTGGAAGATCCTGCTTCTAGAGAATTGGTTGTTTCTTATGTTAATGTCAACACTGGATTGAAAATTAGGCAATTGTTGTGGTTTCATATTTCTTGTTTGACTTTTGGTAGAGAAACTGTTTTGGAATATTTGGTTTCTTTTGGTGTTTGGATTAGAACTCCACCTGCTTATAGACCACAAAAT；所述乙型肝炎病毒e抗原重组蛋白的氨基酸序列为：LIISCSCPTVQASKLCLGWLWGMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNTGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQN。2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原制备方法，其特征在于，所述将所述重组质粒转入大肠杆菌进行扩增培养，得到扩增培养物的步骤包括：取出所述重组质粒，通过化学转化法转化大肠杆菌感受态细胞，得到质粒转化菌液；取所述质粒转化菌液涂布于氨苄抗性平板上，恒温倒置过夜培养，生成质粒转化单菌；取2支试管，各加入LB培养基，再加入氨苄抗生素；从所述氨苄抗性平板上挑取所述质粒转化单菌，接种到试管中，震荡培养至LB培养基出现明显浑浊，得到扩增培养物。3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原制备方法，其特征在于，所述从所述扩增培养物中提取出所述重组质粒进行线性化处理，得到线性化质粒的步骤包括：使用质粒小量抽提试剂盒从所述扩增培养物中提取所述重组质粒；通过限制性内切酶在TRP2区对所述重组质粒进行切割，得到线性化质粒。4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原制备方法，其特征在于，所述将所述线性化质粒转入毕赤酵母，得到质粒转化毕赤酵母，对所述质粒转化毕赤酵母进行培养，获得阳
性酵母单菌的步骤包括：制备所述毕赤酵母感受态细胞；将所述感受态细胞和所述线性化质粒进行混合，得到混合产物；将所述混合产物进行电转化后，得到质粒转化毕赤酵母，并培养所述质粒转化毕赤酵母，得到质粒转化酵母培养物；将所述转化酵母培养物涂布到选择平板上进行培养，培养出阳性酵母单菌。5.根据权利要求4所述的乙型肝炎病毒e抗原制备方法，其特征在于，所述制备所述毕赤酵母感...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄黉，蒋析文，朱伟伟，巩路，孙婧，陈游，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：