心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法技术

本发明专利技术涉及线粒体表达移植领域，尤其涉及心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法，包括制备GPX4和DHODH过表达线粒体，选用SPF级雄性C57BL/6小鼠利用Langendorff法提取成年小鼠心肌细胞于培养皿中，加入构建好的m

【技术实现步骤摘要】
心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法


[0001]本专利技术涉及线粒体表达移植领域，尤其涉及一种心肌线粒体过表达GPX4、DHODH及移植保护心脏的方法。

技术介绍

[0002]血心肌再灌注是目前治疗缺血性心脏病的最有效方法，然而，再灌注本身会对缺血心肌造成损伤，增加细胞凋亡和铁死亡，引起心脏功能障碍和恶性心律失常，严重影响患者的预后。线粒体移植以替代受损线粒体已经在动物研究中进行了初步探索。将健康的线粒体移植到心肌中已被证明对促进受损心肌组织的收缩功能和生存能力是安全有效的。之前的也研究表明，将Alda
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1处理的线粒体移植到小鼠心肌组织中可限制缺血再灌注(I/R)损伤后的梗死大小，增加线粒体电位介导的融合增加，抑制心肌细胞凋亡，在治疗心肌I/R损伤具有巨大潜力。然而，线粒体移植是否能减轻心肌细胞铁死亡，尚未可知。
[0003]胞质和线粒体中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、质膜上的铁死亡抑制蛋白1(FSP1)和线粒体中的二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)构成了铁死亡的三大主要防御系统。其中，DHODH和线粒体GPX4构成了两个主要的防御性武器，消除线粒体中的脂质过氧化物，其中一条路走不通了，都会迫使细胞更依赖于另一条路，当两条路都堵死了，就会触发主要由线粒体脂质过氧化导致的铁死亡。
[0004]在这项研究中，我们发现单纯线粒体移植可减少I/R损伤后的梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，但却难以减轻心肌细胞铁死亡。而GPX4和DHODH过表达的线粒体移植既可以减少心肌梗死面积，抑制了缺氧再氧暴露后的细胞铁死亡。这为线粒体移植应用于临床治疗心肌梗死后心脏重构提供理论依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决
技术介绍
中的问题，而提出的心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法，包括以下步骤：
[0008]S1、制备GPX4和DHODH过表达线粒体，选用SPF级雄性C57BL/6小鼠利用Langendorff法提取成年小鼠心肌细胞于培养皿中，加入构建好的m
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GPX4
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ZV302过表达和m
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DHODH
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ZV302过表达腺病毒，以100MOI的效率转染24小时，之后提取心肌细胞线粒体，评估其转染效率，以100MOI的效率转染24小时；
[0009]S2、制备实验动物及动物模型，选用SPF级雄性C57BL/6小鼠，给予左冠状动脉结扎手术，构建心脏缺血再灌注损伤模型，再灌注后再缺血心肌周围注射75μL PBS、线粒体和GPX4和DHODH过表达的线粒体，注射时间为缺血45min再灌注后；
[0010]S3、制备实验细胞及细胞模型，选用SPF级雄性C57BL/6小鼠提取成年小鼠心肌细胞，构建缺氧复氧模型，复氧后予以PBS、线粒体和GPX4、DHODH过表达的线粒体治疗；
[0011]S4、超声心动图评价小鼠心功能，检测超声心动图，探头频率为30MHz。
[0012]在上述的心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法中，所述S3中的构建缺氧复氧模型需要缺氧6小时，复氧18小时。
[0013]在上述的心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法中，所述S4中具体为异氟烷气麻动物后，当小鼠的心率保持在450
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500次/分钟时记录M
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mode图像。
[0014]在上述的心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法中，在记录M
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mode图像后，釆集胸骨旁长轴切面、心尖四腔切面B
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Mode图像，取胸骨旁左室短轴，2D超声示左室短轴切面，在乳头肌水平应用M型超声记录左心室运动情况。
[0015]综上所述，本专利技术的优点在于：
[0016]1.构建了一种可治疗心肌细胞铁死亡的线粒体并进行了移植，有效证实线粒体移植对心肌细胞铁死亡的抑制作用，小鼠心脏缺血再灌注损伤手术后，GPX4和DHODH过表达线粒体移植可以有效减少心肌细胞铁死亡和心肌缺血面积，改善再灌注后心功能，为线粒体移植应用于临床治疗缺血心肌再灌注损伤提供理论依据。
[0017]2.单纯线粒体移植可减少I/R损伤后的梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，但却难以减轻心肌细胞铁死亡，而GPX4和DHODH过表达的线粒体移植既可以减少心肌梗死面积，抑制了缺氧再氧暴露后的细胞铁死亡，这为线粒体移植应用于临床治疗心肌梗死后心脏重构提供理论依据。
附图说明
[0018]图1为本专利技术中心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法的技术实施方案图；
[0019]图2为本专利技术中Werstern Blot评估线粒体过表达效率示意图；
[0020]图3为本专利技术中超声心动图检测GPX4和DHODH过表达的线粒体移植缺血再灌注损伤小鼠心功能的改善效果示意图；
[0021]图4为本专利技术中死活染色显示GPX4和DHODH过表达的线粒体移植减少心肌细胞死亡示意图；
[0022]图5为本专利技术中线粒体ROS显示GPX4和DHODH过表达的线粒体移植减少线粒体ROS。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0024]在本专利技术的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。
[0025]步骤一、GPX4和DHODH过表达线粒体制备：选用SPF级雄性C57BL/6小鼠利用Langendorff法提取成年小鼠心肌细胞于培养皿中，加入构建好的m
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GPX4
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ZV302过表达和m
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DHODH
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ZV302过表达腺病毒，以100MOI的效率转染24小时，之后提取心肌细胞线粒体，评估其转染效率，以100MOI的效率转染24小时后，心肌细胞线粒体GPX4和DHODH显著上调，具
体参照图2所示。
[0026]具体的SPF级雄性C57BL/6小鼠可以选用周龄为8
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10周，体重20
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25g的小鼠。
[0027]其中m
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GPX4
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ZV302序列为F：gattctagagctagcgaattcatgtgtgcatcccgc；R：at本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.心肌线粒体过表达GPX4、DHODH用于移植保护心脏的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备GPX4和DHODH过表达线粒体，选用SPF级雄性C57BL/6小鼠利用Langendorff法提取成年小鼠心肌细胞于培养皿中，加入构建好的m
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GPX4
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ZV302过表达和m
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DHODH
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ZV302过表达腺病毒，以100MOI的效率转染24小时，之后提取心肌细胞线粒体，评估其转染效率，以100MOI的效率转染24小时；S2、制备实验动物及动物模型，选用SPF级雄性C57BL/6小鼠，给予左冠状动脉结扎手术，构建心脏缺血再灌注损伤模型，再灌注后再缺血心肌周围注射75μL PBS、线粒体和GPX4和DHODH过表达的线粒体，注射时间为缺血45min再灌注后；S3、制备实验细胞及细胞模型，选用SPF级雄性C57BL/6小鼠提取成年小鼠心肌细胞，构建缺氧复氧模...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯尊平，
申请(专利权)人：上海市第五人民医院，
类型：发明
国别省市：