M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，属于脑卒中治疗技术领域。现有研究对脑卒中后神经元激活释放的EVs与脑卒中后炎症反应及神经功能障碍的相关性尚不明确，本发明专利技术采用MCAO小鼠模拟缺血性脑卒中模型，证实了抑制M1区神经元活性能够降低脑梗死面积、改善神经功能障碍及炎症反应，另外本发明专利技术证实了缺血性脑卒中神经元分泌的EVs能够诱导小胶质细胞炎症反应，为脑卒中后相关并发症的治疗提供了相关依据，给出了M1区神经元活性抑制剂作为治疗药物的启示，具有广阔的医学开发前景。广阔的医学开发前景。广阔的医学开发前景。

【技术实现步骤摘要】
M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用


[0001]本专利技术属于脑卒中治疗
，具体涉及M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]缺血性脑卒中由于脑供血不足引起能量代谢障碍，细胞膜去极化、突触前兴奋性递质(如谷氨酸和天冬氨酸)大量释放和离子失衡，导致神经功能损伤。缺血性脑卒中患者经过急性期康复治疗，恢复期后进入并发症期，此时期多数患者具有不同程度的运动、认知和吞咽等障碍。因此，针对缺血性脑卒中后遗留的神经功能障碍的康复治疗研究成为中枢神经系统(Central nervous system，CNS)研究领域关注的焦点。
[0004]化学遗传学是一种通过改造生物大分子物质，使其只接受外源性配体信号的方法。基于G蛋白偶联受体改造的只由特定药物激活的受体(designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs)技术是目前应用最广泛的化学遗传学技术。通过应用选择性配体，氯氮平N
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氧化物(clozapine
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N
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oxide，CNO)可以刺激或抑制谷氨酸能、γ
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氨基丁酸或多巴胺能神经元的某些群体。在神经元中，CNO诱导人M3毒蕈碱受体(human M3 muscarinic receptor,hM3Dq)诱导神经元去极化，增强神经元的兴奋性，即促使神经元的放电活动。而CNO诱导人M4毒蕈碱受体可促进神经元超极化，抑制神经元的兴奋性。
[0005]研究发现，在急性脑缺血动物模型中利用谷氨酸能神经元特异性启动子(CaMKIIα)驱动的DREADDs工具(CaMKIIα
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hM3Dq)选择性激活M1区兴奋性神经元(前脑谷氨酸能神经元)，结果发现CaMKIIα
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hM3Dq处理后可减轻脑缺血大鼠梗死面积，改善线粒体功能障碍和认知功能障碍。Wen
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Yuan Ling等在脑出血动物模型中发现激活M1区谷氨酸能神经元能改善小鼠行为和认知缺陷。在转基因小鼠hM4Di
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TG(其中抑制性hM4Di
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DREADD的表达主要局限于前脑兴奋性神经元)脑缺血模型中，与对照组小鼠相比，在脑缺血前或再灌注后接受CNO处理的hM4Di
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TG小鼠的预后显著改善，结果提示特异性抑制脑缺血前脑兴奋性神经元的激活可促进其神经功能改善。M1区有两类互相拮抗的神经元：一类是谷氨酸能兴奋性神经元，一类是GABA能抑制性中间神经元，结合前期的一些研究，专利技术人推测不同神经元的兴奋状态会影响脑卒中预后。因此本研究中首先明确M1区谷氨酸能兴奋性神经元和GABA能抑制性中间神经元的兴奋状态，然后探讨神经元的兴奋性与缺血性脑卒中神经功能障碍的关系。
[0006]细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是一种新的细胞间通讯方式。EVs是由细胞自主分泌的具有双层膜结构的异质性囊泡状小体。EVs富含蛋白质、脂质和核酸(包
括信使RNA、微小RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA和DNA等)等多种生物活性物质。EVs在正常和疾病状态中通过在细胞之间传递遗传物质、蛋白质和脂质等发挥作用。在CNS中，EVs可从小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元等细胞类型中释放出来，并被认为在CNS的各种生理过程中有助于神经元
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胶质细胞之间的交流。体外培养的神经元释放EVs可被小胶质细胞摄入。神经元来源的EVs中携带的miR
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21
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5p促进小胶质细胞激活，抑制神经突起的生长。相反，另一项研究发现，神经元来源的EVs在体内和体外通过抑制促炎型小胶质细胞和A1型星形胶质细胞的活化促进功能恢复。神经元来源的EVs可以被小胶质细胞摄取并抑制脂多糖诱导的小胶质细胞活化。可见，神经元来源的EVs在神经元和胶质细胞之间的信息交流中发挥着重要作用。
[0007]研究表明，EVs的释放是对神经递质信号的反应，因此脑内EVs释放水平和活动程度由神经元电变化(动作电位或者兴奋)控制。例如，神经元去极化(兴奋)可促进EVs分泌，释放的EVs富含miRNA，后者促进突触可塑性。神经元激活后动作电位抵达轴突末梢，诱导谷氨酸的释放，后者作用于少突胶质细胞的谷氨酸受体，继而释放EVs。研究表明脑卒中后谷氨酸能突触内的活性增加，诱导EVs释放，EVs优先与相邻神经元结合，促进神经元之间的信息传递。脑卒中后神经元激活释放的EVs是否影响炎症反应和神经功能障碍目前尚不清楚。

技术实现思路

[0008]为了证实M1神经激活释放的EVs与缺血性脑卒中诱导的炎症反应具有相关性，本专利技术设计了如下验证实验：
[0009](1)本专利技术采用线栓法建立C57BL/6小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型模拟人类缺血性脑卒中。在MCAO小鼠模型构建前2周，利用脑立体定位注射技术在M1区注射腺相关病毒：AAV9
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hSyn
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HA
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hM3D(Gq)
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IRES
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mCitrine(hM3Dq)和AAV9
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hSyn
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HA
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hM4D(Gi)
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IRES
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mCitrine(hM4Di)。实验分为4组：hM3Dq+MCAO+Vehicle组、hM3Dq+MCAO+CNO组、hM4Di+MCAO+Vehicle组和hM4Di+MCAO+CNO组。发现以下实验结果：利用hM4Di+CNO抑制M1区神经元激活可降低MCAO小鼠脑梗死面积和细胞凋亡，抑制小胶质细胞/巨噬细胞激活，改善MCAO小鼠的神经功能缺损体征，增强前肢肌肉力量以及提高感觉运动功能及协调性。然而利用hM3Dq+CNO促进M1区神经元激活并不影响MCAO小鼠脑梗死面积、细胞凋亡、小胶质细胞/巨噬细胞激活和神经功能异常。
[0010](2)利用PC12细胞构建体外神经元“缺血再灌注”损伤模型即氧糖剥夺/复氧(Oxygen
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Glucose Deprivation/Reoxygenation，OGD/R)模型，并利用超速离心法提取PC12细胞上清中的EVs。结果发现，OGD/R处理可上调PC12细胞内[Ca
2+
]i和c
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Fos水平，提示OGD/R可激活神经元。收集PC12细胞来源的EVs孵育体外培养的小胶质细胞，结果发现EVs可被小胶质细胞摄入。与Nor
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，其特征在于，所述M1区神经元活性抑制剂为含有hM4Di人工受体的腺病毒及CNO。2.如权利要求1所述M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，其特征在于，所述含有hM4Di人工受体的腺病毒通过注射或靶向基团修饰等方式定向作用于M1区。3.如权利要求1所述M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂的施用方式如下：受试者脑部M1区定位注射hM4Di人工受体感染一段时间后，再进行CNO注射实现M1区脑神经元活性抑制。4.如权利要求1所述M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，其特征在于，所述缺血性脑卒中防治药物为用于预防、改善或治疗缺血性脑卒中及并发症的药物。5.如权利要求4所述M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，其特征在于，所述缺血性脑卒中包括脑梗死。6.如权利要求4所述M1区神经...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贞，辛丹清，刘德祥，赵一静，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：