一种中华鳖雌性特异Rab35基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于中华鳖育种技术领域，尤其涉及一种中华鳖雌性特异Rab35基因及其应用。所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供的Rab35基因作为雌性特异基因，通过检测中华鳖个体中该基因的有无，可实现在基因层面快速、高效地检测个体性别，有利于实现多样本、大规模群体的性别鉴定，不受样本量和养殖时期的限制，在中华鳖性别鉴定领域具有广阔的应用前景。而且，通过降低该基因的表达或敲除该基因，可以实现中华鳖雌性个体的性别逆转，为有目的地人为决定中华鳖性别提供了新的解决方案，为高效培育雄性个体和实现单性养殖提供了科学依据，具有重要的市场价值和较高的经济效益。济效益。济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种中华鳖雌性特异Rab35基因及其应用


[0001]本专利技术涉及中华鳖育种
，特别涉及一种中华鳖雌性特异Rab35基因及其应用。

技术介绍

[0002]中华鳖(Pelodiscus sinensis)属爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(sinensis)，俗称甲鱼、水鱼、团鱼，是我国重要的名特优水产养殖品种，主要分布于我国的长江流域、黄河流域和华南地区。作为深受消费者喜爱的“名特优”水产养殖品种，中华鳖是我国传统的滋补佳品，具有较高的食用和药用价值。中华鳖不同性别和个体间存在着明显的生长差异，雄性个体大，生长速度远远优于雌性，而且裙边宽厚，肌肉中脂肪少，营养价值更高，因此在中华鳖养殖过程中存在“去雌留雄”的普遍现象，实现全雄或高雄繁育的养殖模式可提高养殖产量，增加经济效益。因此，中华鳖的性别控制研究已成为中华鳖育种和养殖的研究热点。
[0003]在水产动物中，由性别不同导致的生产性能差异对水产养殖业具有重要的意义，是研究水产动物性别控制的原动力。目前在中华鳖的性别控制研究方面，有温度诱导和外源激素诱导等方法，这些方法均可获得一定比例的性逆转个体。但是前述方法存在很大的不确定性，较难达到彻底的性逆转效果，个体雄性化的比率不高，且高剂量的外源激素极易导致胚胎发育以及性腺发育的不正常，而且通常需要较长的时间实现性逆转，此外，需要实时监控环境温度和每天滴加药物，操作繁琐，生产效益不高。基于此，开发新的性别控制方法刻不容缓。尽管已开展大量关于中华鳖性别控制及单性繁育的相关探索，但未能取得实质性进展，究其根本原因，是中华鳖性别决定机理研究的还非常有限，尚未有明确结论，解析中华鳖性别决定的分子机制是不可或缺的一步，性别特异基因的获得则是阐述其性别决定分子机制及性别控制育种的重要前提。然而，迄今为止有关中华鳖的性别决定基因仍是未知，因此急需挖掘更多的中华鳖性别特异基因。
[0004]此外，在中华鳖全雄或高雄育种过程中，准确鉴定性逆转的雄性化个体，对于中华鳖性别控制和全雄苗种培育研究具有重要的意义。目前，并没有有效的鉴定中华鳖性别的方法，常规通过例如核型分析或分析比较基因组杂交图鉴别中华鳖胚胎及稚鳖的性别难度大，花费时间长，且存在一定的错误率；也可以通过组织切片等方式对中华鳖的生理性别进行鉴定，但是需要解剖采集性腺组织，创伤性大，易造成中华鳖的死亡，而且前述方法无法实现大批量、多样本群体材料的高效检测。基于中华鳖性别特异基因开发一种基因层面的鉴定方法为中华鳖个体高效、快速、便捷的性别鉴定难题提供了解决思路。
[0005]综上，寻找中华鳖性别特异相关基因、并对中华鳖性别特异基因的功能分析和性别调控应用进行研究，在基因水平探讨中华鳖性别决定机制和性别分化机理对于中华鳖雄性个体快速筛选、鉴定和水产养殖高效选育良种意义重大。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种中华鳖雌性特异Rab35基因，并提供了该基因的应用，尤其是在中华鳖性别鉴定或性别控制育种中的应用，以解决或至少缓解现有技术中的部分问题。
[0007]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0008]本专利技术的第一方面提供了一种中华鳖雌性特异Rab35基因，所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术的第二方面提供了如上所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别鉴定中的应用。
[0010]进一步地，利用PCR扩增技术进行中华鳖性别鉴定，包括以下步骤：
[0011]S11、以中华鳖待测个体的基因组DNA或者cDNA作为模板，以SEQ ID NO.2
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3所示或SEQ ID NO.4
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5所示的引物对，通过PCR扩增所述Rab35基因；
[0012]S12、检测步骤S11的扩增产物中是否含有所述Rab35基因，若存在所述Rab35基因，则所述待测个体为雌性个体，若不存在所述Rab35基因，则所述待测个体为雄性个体。
[0013]进一步地，当以所述待测个体的基因组DNA作为模板时，采用SEQ ID NO.4
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5所示的引物对进行扩增；
[0014]当以所述待测个体的基因组cDNA作为模板时，采用SEQ ID NO.2
‑
3所示的引物对进行扩增。
[0015]进一步地，步骤S11中，PCR扩增反应体系以20μL计，包括：10μL PCR Mix，正向引物和反向引物各1μL，模板1μL，超纯水7μL；PCR扩增程序包括：94℃30s，98℃10s，58℃
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60℃30s，72℃60s，35循环，72℃2min，16℃∞。
[0016]进一步地，步骤S12中，通过测序技术或者琼脂糖凝胶电泳技术检测步骤S11的扩增产物中是否含有所述Rab35基因。
[0017]本专利技术的第三方面提供了如上所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别控制育种中的应用。
[0018]进一步地，利用RNA干扰技术进行中华鳖性别控制育种，包括以下步骤：
[0019]S21、设计靶向Rab35基因的干扰RNA，将所述干扰RNA的编码序列插入到出发载体中，构建用于干扰所述Rab35基因表达的干扰载体；其中，所述干扰RNA的编码序列如SEQ ID NO.6所示；
[0020]S22、将所述干扰载体转入中华鳖胚胎，孵化所述胚胎，获得所述Rab35基因表达水平降低的转基因中华鳖。
[0021]进一步地，步骤S21中，所述出发载体为腺病毒载体pAdEasy
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U6
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CMV
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EGFP。
[0022]进一步地，步骤S22中，转入方法包括显微注射法、基因枪法或电击法。
[0023]本专利技术的第四方面提供了一种中华鳖性别鉴定试剂盒，所述性别鉴定试剂盒包括扩增Rab35基因的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.2
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3或SEQ ID NO.4
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5所示，所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0024]本专利技术的第五方面提供了一种中华鳖性别控制育种试剂盒，所述性别控制育种试剂盒包括干扰载体，所述干扰载体插入有靶向所述Rab35基因的干扰RNA的编码序列，用于干扰所述Rab35基因表达，所述干扰RNA的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述Rab35基因的
cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0025]本专利技术的优点及积极效果为：
[0026]本专利技术提供的Rab35基因作为雌性特异基因，通过检测中华鳖个体中该基因的有无，可实现在基因层面快速、高效地检测个体性别，有利于实现多样本、大规模群体的性别鉴定，不受样本量和养殖时期的限制，在中华鳖性别鉴定领域具有广阔的应用前景。而且，通过降低该基因的表达或敲除该基因，可以实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中华鳖雌性特异Rab35基因，其特征在于，cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别鉴定中的应用。3.根据权利要求2所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别鉴定中的应用，其特征在于，利用PCR扩增技术进行中华鳖性别鉴定，包括以下步骤：S11、以中华鳖待测个体的基因组DNA或者cDNA作为模板，以SEQ ID NO.2
‑
3所示或SEQ ID NO.4
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5所示的引物对，通过PCR扩增所述Rab35基因；S12、检测步骤S11的扩增产物中是否含有所述Rab35基因，若存在所述Rab35基因，则所述待测个体为雌性个体，若不存在所述Rab35基因，则所述待测个体为雄性个体。4.根据权利要求3所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别鉴定中的应用，其特征在于，当以所述待测个体的基因组DNA作为模板时，采用SEQ ID NO.4
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5所示的引物对进行扩增；当以所述待测个体的基因组cDNA作为模板时，采用SEQ ID NO.2
‑
3所示的引物对进行扩增。5.根据权利要求3所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别鉴定中的应用，其特征在于，步骤S11中，PCR扩增反应体系以20μL计，包括：10μL PCR Mix，正向引物和反向引物各1μL，模板1μL，超纯水7μL；PCR扩增程序包括：94℃30s，98℃10s，58℃
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60℃30s，72℃60s，35循环，72℃2min，16℃∞；步骤S12中，通过测序技术或者琼脂糖凝胶电泳...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，朱新平，雷骆，祝骏贤，陈辰，刘晓莉，洪孝友，纪利芹，汪永昌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：