筛选能够与多个靶分子一起形成复合体的候选分子的方法技术

本文发现了通过在以Split GFP技术为代表的技术中应用利用亲和性的候选分子回收方法来筛选能够与多个靶分子一起形成复合体的分子的方法。在该方法中，使连结到蛋白质的第1部分的第1靶分子、连结到该蛋白质的第2部分的第2靶分子、以及包含多个受试分子的文库共存。然后，使用亲和性技术，回收能够与连结到该第1部分的第1靶分子和连结到该第2部分的第2靶分子形成复合体的受试分子。形成复合体的受试分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】筛选能够与多个靶分子一起形成复合体的候选分子的方法


[0001]本公开涉及筛选能够与多个靶分子一起形成复合体的候选分子的方法。

技术介绍

[0002]作为与多个靶分子一起形成复合体的分子，已知有以双特异性抗体、蛋白质分解诱导嵌合体(Proteolysis targeting chimera；PROTAC)为代表的双特异性分子、以及如雷帕霉素或FK506那样通过与FKBP(FK506 binding protein)的结合而与靶分子结合的分子。作为前者的分子的制作方法，已知有在分别获得能够与不同的靶结合的分子后，将它们连结的方法(非专利文献1)。作为后者的分子的获得方法，已知有将试验化合物与FKBP混合而形成二者复合体后，将其与靶蛋白混合，通过质谱检测三者复合体的形成的方法(专利文献1)。
[0003]Split GFP技术是利用以单独不发光的方式被切割的GFP蛋白质接近、缔合而发光的现象的技术。通过在各GFP片段结合不同的蛋白质，可以以GFP的发光为指标检测蛋白质彼此的相互作用。具体而言，有报告称，以β链单位将GFP分割成GFP1
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9、GFP10及GFP11这3部分，使另外的蛋白质分别与GFP10及GFP11结合，添加GFP1
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9时，能够通过发光检测这些蛋白质的相互作用(非专利文献2)。有报告称，使用表达了split GFP的细胞，以在细胞内通过GTPase和GTPase
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结合结构域(binding domain)的相互作用的发光为指标，检测GTPase的活化状态(专利文献2、非专利文献3)。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献1：美国专利US9428845号
[0007]专利文献2：美国专利申请公开20180164324号
[0008]非专利文献
[0009]非专利文献1：Ulrich,H.W.et al.CANCER GENOMICS&PROTEOMICS 10:1
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18(2013)
[0010]非专利文献2：Cabantous,S.et al.Sci Rep.2013；3:2854.doi:10.1038/srep02854
[0011]非专利文献3：Koraichi,F.et al.Journal of Cell Science 2018；131:jcs210419doi:10.1242/jcs.210419

技术实现思路

[0012]专利技术要解决的课题
[0013]在要获得与多个靶分子一起形成复合体的分子的情况下，可以考虑(i)将对每个靶分子进行筛选而得到的结合物连结的方法、(ii)在获得对一个靶分子的结合物后，使该靶分子和结合物的复合体与另一个靶分子接触的方法。
[0014]在提高口服吸收性或瞄准细胞内靶标时，需要使候选分子的分子量减小一定程度。因此，在以这样的目的而要获得候选分子的情况下，在获得对各靶分子的结合物后，将
它们连结的(i)方法中，对各个结合物的分子量有很大的限制。一方面，由于使分子量过小时，对可用于结合的候选分子侧的结构、靶分子侧的结合部位产生限制，因此可应用的靶分子受到限制。另一个(ii)的方法不是连结两个分子，而是从文库中筛选具有所需性质的分子，但通过单一特异性对单独的靶分子进行筛选成为第一工序。在该工序中，由于对该靶(第1靶)分子具有优势结合方式的分子被浓缩，因此在下一工序中，必须从偏向于对第1靶的结合方式的分子群中筛选具有所需性质的分子。由于对第1靶分子的优势结合方式不一定与用于与多个靶分子形成复合体的结合方式一致，因此所筛选的化合物的多样性受到限制。要求能够从可产生与各靶分子的多种结合方式的文库中，直接筛选具有所需性质的分子的筛选方法。
[0015]另外，不仅要求对单一靶分子的结合活性，还对候选分子要求各种性质，越是这样，从包含多种受试分子的文库中进行筛选的必要性越高。此外，为了与多个靶分子一起形成复合体，候选分子需要带来复杂的结合和反应方式，此时由于最佳的分子结构难以预测，因此要求尽量能够应用于有多样性的文库，候选分子的选择和鉴定简便的高通量的筛选方法。
[0016]Split GFP技术用于检测蛋白质
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蛋白质相互作用(PPI)(非专利文献2)，但由于以GFP的发光为指标，因此将其应用于筛选时的通量性不高。即，在通过荧光检测的情况下，由于需要在孔等的一个一个的封闭空间中准备靶分子和单一候选分子，因此花费时间和成本，对可处理的受试分子的数量有限制。为了效率化，即使假设在各封闭空间中准备包含多个受试分子的文库而尝试筛选，为了选择、鉴定特定的候选分子，也需要阶段性地进行多次测定，直到仅能确认单一分子的荧光为止，与前者同样地通量性不高。从这样的观点出发，要求通过代替以GFP蛋白质的发光为指标的方法的新方法，检测被分割的蛋白质的接近或缔合并将其回收。
[0017]本专利技术是鉴于这样的状况而完成的，其课题之一在于提供能够与多个靶分子一起形成复合体的分子的筛选方法。
[0018]用于解决课题的手段
[0019]本专利技术人等认为使文库中所含的受试分子和多个靶分子共存于同一体系中进行筛选是产生与靶分子的多个反应方式的最有效的方法。从而由此发现了在以Split GFP技术为代表的技术中应用利用亲和性的候选分子的回收方法而筛选能够与多个靶分子一起形成复合体的分子的方法。发现在本方法中能够抑制仅与一个靶分子形成复合体的受试分子的回收率，同时能够回收与多个靶分子一起形成复合体的候选分子。
[0020]本专利技术基于这样的见解，在非限定的具体的一个方式中包含以下内容。
[0021][1]一种筛选能够与第1靶分子和第2靶分子一起形成复合体的候选分子的方法，其包括以下工序(1)和(2)：
[0022]工序(1)：将连结到第1部分的所述第1靶分子、连结到第2部分的所述第2靶分子、以及包含多个受试分子的文库混合，其中该第1部分和该第2部分构成蛋白质的一部分或全部，以及
[0023]工序(2)：在工序(1)之后，使用利用能够检测所述第1部分和所述第2部分接近或缔合的第3分子介导的亲和性的方法，回收包含所述第1靶分子、所述第2靶分子、以及所述候选分子的复合体。
[0024][1.1]根据[1]所述的方法，其中，工序(2)中的所述第1靶分子是连结到所述第1部分的第1靶分子，所述第2靶分子是连结到所述第2部分的第2靶分子。
[0025][2]根据[1]或[1.1]所述的方法，其进一步包括工序(3)：
[0026]工序(3)：在工序(2)之后，对回收的复合体中所含的候选分子进行鉴定。
[0027][3]根据[1]～[2]中任一项所述的方法，其中，所述第3分子是在所述第1部分和所述第2部分接近或缔合的情况下与所述第1部分和/或所述第2部分反应的分子。
[0028][4]根据[1]～[3]中任一项所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种筛选能够与第1靶分子和第2靶分子一起形成复合体的候选分子的方法，其包括以下工序(1)和(2)：工序(1)：将连结到第1部分的所述第1靶分子、连结到第2部分的所述第2靶分子、以及包含多个受试分子的文库混合，其中该第1部分和该第2部分构成蛋白质的一部分或全部，以及工序(2)：在工序(1)之后，使用利用能够检测所述第1部分和所述第2部分接近或缔合的第3分子介导的亲和性的方法，回收包含连结到所述第1部分的第1靶分子、连结到所述第2部分的第2靶分子、以及所述候选分子的复合体。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括工序(3)：工序(3)：在工序(2)之后，对回收的复合体中所含的候选分子进行鉴定。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第3分子是在所述第1部分和所述第2部分接近或缔合的情况下与所述第1部分和/或所述第2部分反应的分子。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述第3分子是在所述第1部分和所述第2部分既没有接近也没有缔合的情况下与所述第1部分和/或所述第2部分实质上不反应的分子。5.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其中，在工序(2)与工序(3)之间进一步包括工序(2A)：工序(2A)：从包含连结到所述第1部分的第1靶分子、连结到所述第2部分的第2靶分子、以及所述候选分子的复合体中，洗脱所述候选分子。6.根据权利要求5所述的方法，其中，工序(3)包括确定编码工序(2A)中被洗脱的候选分子的多核苷酸序列。7.根据权利要求1～6中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：小岛哲郎，西村香绪梨，栗木优五，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：