海水青鳉母源效应基因org及其sgRNA片段制造技术

本发明专利技术公开了一种海水青鳉母源效应基因org及其sgRNA片段，属于分子生物学技术领域，所述海水青鳉母源效应基因org的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，sgRNA片段序列为SEQ ID NO.2

【技术实现步骤摘要】
海水青鳉母源效应基因org及其sgRNA片段


[0001]本专利技术属于分子生物学
，设计了一种海水青鳉母源效应基因org及其sgRNA片段。

技术介绍

[0002]母源效应基因(MEGs)在卵母细胞生长发育过程中转录母源因子并积累在卵母细胞细胞质中，这些母源因子参与动物卵母细胞减数分裂恢复，受精后雌雄原核融合以及早期胚胎合子基因激活等过程。这些母源效应基因在不同的过程中发挥特异性的功能，保证生命体活动的正常进行。近年来，研究人员在哺乳动物中鉴定了许多母源效应基因，包括小鼠中Hsf1、Bnc1、Figla和Nlrp5基因，然而在鱼类中母源效应基因的挖掘还不够深入，特别是海水青鳉的母源效应基因功能研究较少。海水青鳉已被公认为亚洲地区生态毒理学和环境研究的模式鱼类，具有繁殖周期短(3
‑
4个月)，每日产卵，小尺寸(3
‑
4厘米)，透明胚胎，以及易于在实验室中进行大规模培养等特征，这些特点使海水青鳉成为体内基因功能试验的模式生物。
[0003]近几年，CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展取得了革命性的成功，在模式生物青鳉中的应用也越来越成熟。如研究人员通过CRISPR/Cas9技术获得了白化的青鳉，为研究色素沉着提供了重要的平台。此外，通过非同源末端连接的方法将含有热休克启动子和报告基因的供体质粒转入青鳉胚胎中，高效生成了敲入型转基因青鳉鱼，并促进了基因功能分析。这些为我们利用CRISPR/Cas9技术以海水青鳉为实验对象研究基因功能提供了理论和实验基础。
专利
技术实现思路

[0004]本专利技术通过CRISPR/Cas9技术鉴定了海水青鳉母源效应基因org及其sgRNA片段。发现海水青鳉org基因与其他母源效应基因一致，它的缺失将导致胚胎无法完成早期合子基因组的激活和母本向合子转变的遗传控制过程，造成早期胚胎发育停滞并最终死亡。此外，我们发现org基因与其他母源效应基因在早期胚胎发育中的表达模式一致。
[0005]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：
[0006]本专利技术的第一方面提供一种海水青鳉母源效应基因org，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0007]本专利技术的第二方面提供org基因的sgRNA，SEQ ID NO.2:GGTGGGTCCAGAGCGCTCTG和SEQ ID NO.3:CTCAGCGTTTCCACCCAGGA。
[0008]本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术首次克隆了海水青鳉卵子发生相关基因org，设计并合成了org基因的sgRNA，检测了sgRNA的有效性。我们利用CRISPR/Cas9技术成功敲除了海水青鳉早期胚胎中的org基因，实验组中org基因的缺失导致胚胎无法完成早期合子基因组的激活以及母本向合子转变的遗传控制过程，造成早期胚胎发育停滞并最终死亡，这与其他母源效应基因敲除后胚胎发育一致。此外，我们研究了org基因在早期胚胎
发育中的表达模式，与其他母源效应基因一致，在合子激活期表达量十分丰富，并在完成母本向合子转变的遗传控制过程后降解。证明了org作为母源效应基因在早期胚胎发育中的重要作用。
[0009]本专利技术提供org基因的核苷酸序列，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；提供org基因靶位点序列及设计合成的sgRNA序列SEQ ID NO.2
‑
3，提供用于扩增靶位点片段的引物，所述引物序列分别为org
‑
gRNAF12、org
‑
gRNAF3和org
‑
gRNAR。此外，本专利技术提供海水青鳉养殖及胚胎显微注射的具体步骤，sgRNA设计及合成的具体步骤；海水青鳉单个胚胎DNA提取的步骤以及用于RT
‑
qPCR的引物：O.melastigma
‑
qF、O.melastigma
‑
qR、O.melastigma
‑
actin
‑
qF、O.melastigma
‑
actin
‑
qR。
附图说明
[0010]图1为本专利技术实施例3中的org基因靶位点序列图。
[0011]图2为本专利技术实施例3中的sgRNA合成纯化后的电泳结果图。
[0012]图3为本专利技术实施例4中的野生组胚胎及实验组胚胎发育的表型图。
[0013]图4为本专利技术实施例5中的SEQ ID NO.2工作效率检测峰图。
[0014]图5为本专利技术实施例5中的SEQ ID NO.3工作效率检测峰图。
[0015]图6为本专利技术实施例6中的org基因在早期胚胎发育中的表达模式图。
具体实施方式
[0016]下面将结合实例中的附图，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术工作人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0017]实施例1：海水青鳉养殖及受精卵收集包括以下步骤：
[0018]1、海水青鳉及胚胎养殖
[0019]海水青鳉循环养殖系统购于上海海圣生物实验设备有限公司。循环系统水温26℃，PH范围维持7.0—8.0，盐度范围32
‑
34，溶解氧5—8mg/L，光周期为14小时(8：00—22：00)光照和10小时(22：00—8：00)黑暗。根据海水青鳉交配产卵特性，每个鱼缸中雌鱼与雄鱼比例为3：2，养殖密度一般5—10尾/L，每日进食新鲜的蠕虫2
‑
3次，保证海水青鳉的生长和繁殖。成年海水青鳉每条每日产卵30
‑
50颗，在其产卵后及时取卵，放在培养皿中进行培养，且每日更换培养皿中的海水，保证海水中充足的含氧量，维持胚胎的正常发育。
[0020]2、海水青鳉受精卵收集
[0021]在显微注射前一晚，将性成熟海水青鳉雌雄分缸，每个鱼缸中雌鱼6
‑
8尾，雄6尾，注射当天系统亮灯前一小时将雌雄青鳉合为一缸，雌鱼开始产卵，雄鱼在系统亮灯之后去追尾并完成受精。根据雌鱼产卵的数量和后期实验的安排可以实时调整实验中雌雄鱼的数量。
[0022]受精后约半小时，受精卵发育到单细胞时期，将挂在生殖孔周围的胚胎及时取下，用循环系统水清洗2
‑
3遍，显微镜下观察胚胎的发育时期，用吸管吸取单细胞时期胚胎并排列在制备好的胚胎卡槽上，显微镜视野中用调整胚胎位置，使其动物极与显微注射针在一
条直线上。剩余胚胎置于冰上或4℃冰箱，减慢分裂速度。二细胞时期之后的胚胎不再适用显微注射。
[0023]实施例2：海水青鳉胚胎显微注射包括以下步骤：
[0024]1、显微注射胚胎卡槽的制备
[0025]取2％的琼脂溶解于50mL无菌水，微波炉加热直至沸腾倒入70mm无菌培养皿中，厚度约2/3，将排卵模具带有棱纹的一面放入培养皿的琼脂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海水青鳉母源效应基因org，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。2.权利要求1所述海水青鳉母源效应基...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵长伟，赵晓娜，王洪岩，王倩，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：