采用非线性光散射的革兰氏染色区分制造技术

本发明专利技术总体上涉及经由小分子差异转运动力学表征细菌样本的细胞壁复合物组成的改善方法。本发明专利技术还涉及使用非线性光学技术进行革兰氏区分细菌样本的改善自动化方法。兰氏区分细菌样本的改善自动化方法。兰氏区分细菌样本的改善自动化方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】Surfaces B:Biointerfaces.2015,127:122
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129；R.J.Tran,et al.,Annu.Rev.Anal.Chem.2017,10:387
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414；Wilhelm MJ,Dai HL.,Chem.Asian.J.,2020,15(2):200
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213；Gayen A,et al.,Anal.Chem.,2019,91(12):7662
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7671；Miller LN,et al.,Biophys.J.,2019,117(8):1419
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1428；Hou Y,et al.,J.Phys.Chem.B.,2019,123(17):3756
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3762；Chen,S.L.,et al.,Materials Today Physics,2019,9:100092；Shang,X.,et al.,J.Phys.Chem.B.,2001,105:12816
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12822)。正如最近的明证，这甚至能够用作成像模式(Sharifian Gh M,etal.,Biochemistry.2019,58(14):1841
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1844)。用SHS监测膜吸附和转运的一般工作原理如下：任何缺乏反转对称性的分子都具有以两倍于强入射场频率的频率进行光散射的能力(即，入射ω＝800nm的光在2ω＝400nm处散射)。对于液体中这种分子的集合，当分子随机取向时，生成的SH辐射相消求和为零。然而，在SH活性阳离子静电驱动吸附于膜双层外表面上之后，随着分子以相似取向排列，其所得的SHS呈建筑式叠加而产生可检测信号。此外，如果SH活性分子能够穿过双层并吸附于膜的相对内表面上，则由相反取向的SH活性分子产生的SHS将是异相的(out of phase)，导致相消相干且SHS信号消失。
[0007]此前，阳离子革兰氏染色染料结晶紫(CV)的时间分辨SHS在被革兰氏阴性菌活大肠杆菌吸收时受到监测(M.J.Wilhelm,et al.,ACS Chem.Biol.2015,10:1711
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1717)。与先前公认的革兰氏染色机制的解释形成鲜明对比的是，其表明CV无法穿过细菌CM。此后，在随后的一项使用仿生脂质体(由大肠杆菌的总脂质提取物组成)的研究中验证了这一行为，其中CV无法穿过脂质体的膜(Wilhelm MJ,et al.,J.Chem.Phys.,2019,150(10):104705)。此外，还观察到阳离子CV与PM表现出强烈的相互作用。以前会认为，CV会迅速穿过PM，但会在醇洗步骤中作为CV
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碘沉淀而被捕获(T.J.Beveridge,et al.,J.Bacteriol.1983,156:846
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858；BeveridgeTJ.,J.Bacteriol.,1990,172(3):1609
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1620；Beveridge TJ.,Biotech.Histochem.,2001,76(3):111
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118)。然而，即使对于相对较薄的大肠杆菌PM，也观察到CV在革兰氏染色方案的时间尺度内被动力学地捕获于PM中(M.J.Wilhelm,et al.,ACS Chem.Biol.2015,10:1711
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1717)。因此，考虑到革兰氏阳性细胞中显著较厚的PM(约100nm相对于10nm)，强CV
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PM相互作用应会致使产生与用革兰氏阴性细胞观察到的信号明显不同的测得SHS信号。
[0008]传统的革兰氏染色(用于受检查的细菌鉴别为革兰氏阳性或革兰氏阴性)是任一临床微生物实验室中最常进行的诊断测试。传统革兰氏染色方案的最大问题是操作员容易出错。目前的方案由八个步骤组成，如果操作不当，其任一步骤都容易导致结果不明确，并甚至潜在地导致分类不正确。许多的当前方案步骤涉及诱导细菌细胞壁复合物显著损伤的可能性，因此会无意中改变CV
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细胞相互作用。例如，第一步是对样品进行热固定(即，在明火上挥动涂有样品的显微镜载玻片)。此步骤的目的是将细胞粘附于载玻片上。不幸的是，这一过程也容易杀死细胞和/或诱导细胞壁复合物组分的级联损伤，并导致所有细胞显现出革兰氏阴性。接下来的步骤包括用醇冲洗色斑(菌斑，斑点，stain)，其中革兰氏阳性细胞应当保留染色，而革兰氏阴性细胞应当失去染色。然而，问题在于，已知醇会使蛋白质变性并溶解磷脂膜。因此，类似于热固定步骤，如果冲洗步骤的持续时间太长，则细胞容易受损，并且革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞都将被分类为革兰氏阴性。相反，如果冲洗步骤的持续时间不够长(即，使之完全去除革兰氏阴性菌的所有染色)，革兰氏阴性细胞可能会无意中被归类为革兰氏阳性。总之，革兰氏染色方案的成功应用需要一名训练有素且经验丰富的
技术人员。然而，即便如此，不同的技术人员也可能会得出相互冲突的任务。事实上，许多研究强调了革兰氏染色评价有关的实验室间可靠性的现有问题。由于操作人员容易出错，以及可能出现不明确的解释，该方案之前要求革兰氏染色分类只能由执业医生进行，而不是由训练有素的技术人员进行。
[0009]因此，本领域需要细菌的革兰氏染色区分的改善系统和方法。本专利技术满足了这一未满足的需求。

技术实现思路

[0010]在一个实施方式中，本专利技术包括确定细菌细胞壁组成的方法，其包括以下步骤：测量溶液中小分子的第一二次谐波散射(second
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harmonic scattering，SHS)信号以生成基线；向所述溶液中加入细菌样品以生成悬浮液；测量所述悬浮液的第二SHS信号以生成响应；和确定所述响应高于还是低于所述基线。
[0011]在本专利技术的一个实施方式中，所述第一或所述第二SHS信号的所述测量包括：将所述溶液或所述悬浮液暴露于基础光源；和检测所述光的二次谐波波长。在一个实施方式中，所述基础光具有约800nm的波长。在一个实施方式中，所述约800nm的基础光的源是钛
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蓝宝石激光器。在一个实施方式中，所述二次谐波波长约为400nm。
[0012]在本专利技术的一个实施方式中，所述约400nm的二次谐波波长穿过带通过滤器和单色仪，由光电倍增管检测，放大，并通过相关光子计数系统处理。在一个实施方式中，所述带通过滤器和单色仪排除所述基础光的波长的光。
[0013]在本专利技术的一个实施方式中，所述小分子被所述细菌样品吸收。在一个实施方式中，所述小分子包含非对称染料。在一个实施方式中，所述非对称染料是结晶紫(CV)。在一个实施方式中，所述CV以至少35μM的浓度存在。在一个实施方式中，所述CV以约50μM的浓度存在。
[0014]在本专利技术的一个实施方式中，所述基线测量1
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100秒。在一个实施方式中，所述响应测量至少100秒。
[0015]在本专利技术的一个实施方式中，保持高于所述基线的所述响应将所述细菌样品表征本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定细菌细胞壁组成的方法，包括以下步骤：a.测量溶液中小分子的第一二次谐波散射(SHS)信号以生成基线；b.将细菌样本添加到所述溶液中以生成悬浮液；c.测量所述悬浮液的第二SHS信号以生成响应；以及d.确定所述响应高于还是低于所述基线。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二SHS信号的所述测量包括：a.将所述溶液或所述悬浮液暴露于基础光源；以及b.检测所述光的二次谐波波长。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基础光具有约800nm的波长。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述约800nm的基础光的源是钛
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蓝宝石激光器。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述二次谐波波长为约400nm。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述约400nm的二次谐波波长穿过带通过滤器和单色器，由光电倍增管检测，放大，并且通过相关光子计数系统进行处理。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述带通过滤器和单色器排除所述基础光的波长的光。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述小分子被所述细菌样本吸收。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述小分子包括非对称染料。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述非对称染料是结晶紫(CV)。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述CV以至少35μM的浓度存在。12.根据权利要求11所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴海龙，穆罕默德，
申请(专利权)人：戴海龙穆罕默德，
类型：发明
国别省市：