基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒及其应用制造技术

本申请实施例属于免疫诊断技术领域，涉及一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒及其应用，试剂盒包括时间分辨荧光试纸，时间分辨荧光试纸包括PVC底板、硝酸纤维素膜、时间分辨荧光结合垫、样品垫和吸水纸；其中，硝酸纤维素膜粘附在PVC底板上，时间分辨荧光结合垫和吸水纸分别粘附在NC膜的两端，所述样品垫粘附在时间分辨荧光结合垫的远离所述硝酸纤维素膜的一端，所述时间分辨荧光结合垫上固定有荧光微球标记的GP73单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线，其中，所述检测线包被有GP73单克隆抗体，所述质控线包被有鸡IgY抗体。本申请试剂盒检测的灵敏度和准确性高，且检测耗时短。且检测耗时短。且检测耗时短。

【技术实现步骤摘要】
基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒及其应用


[0001]本申请涉及免疫诊断
，尤其涉及基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]我国是乙型肝炎大国，由乙型肝炎发展所致的肝硬化和肝细胞肝癌已为我国医疗资源带来了很大的负担。肝癌的发病率仅次于肺癌和胃癌，居第三位。其死亡率仅次于肺癌。由于肝癌的早期诊断对于有效治疗和长期生存至关重要，因此，十分强调肝癌的早期筛查和早期检测。
[0003]甲胎蛋白(α
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fetoprotein，AFP)是一种糖蛋白。正常情况下，来自胚胎的肝细胞和卵黄囊，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液中消失。正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20μg/L。1956年发现，60年代末应用于临床，70年代用于自然人群与肝癌高危人群普查。至今被公认为优秀的肝癌诊断标记物而广泛使用。
[0004]高尔基体糖蛋白
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73(Golgi Protein 73，GP73)又称Ⅱ型高尔基体膜蛋白(Golgi phosphoprotein2，GOLPH 2)是存在于高尔基体的一种跨膜蛋白，分子量73KD，恒定表达于正常肝脏的胆管上皮细胞，肝实质细胞中很少表达或几乎不表达。其在慢性肝炎、肝硬化等病人血清中浓度升高，而在肝细胞肝癌病人血清中升高更加明显，和正常人或良性肝病病人之间呈显著差异。荷兰伊拉斯莫斯大学医疗中心的一项荟萃分析显示，GP73作为一种新的血清标志物，其价值优于AFP，可用于肝癌诊断和监测。GP73对于评估术后效果、检测肝癌复发也具有重要意义。因此，GP73是对肝癌诊断非常有价值的生物标志物，可提高肝癌的早期诊断、早期治疗水平。
[0005]目前，高尔基体糖蛋白73常用的检测方法有酶联免疫法、化学发光免疫分析法、免疫层析法，这些方法都是基于抗原抗体特异性结合反应进行的检测。
[0006](1)酶联免疫方法(ELISA)是较为常用的一种技术，是通过固相的抗原或者抗体和酶标后的抗原和抗体结合，常见的结合方式有双抗夹心法和间接法。酶联免疫法主要原理是采用双抗夹心的方法进行检测，包被抗体吸附于固相的载体表面，用来和特异抗原结合，当待测物中含有特异抗原时，与其形成抗原
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抗体的复合物。再加入另一种用酶标记的抗体作为检测抗体，这种方式可以保留酶的活性和抗体的免疫学活性，用来提高ELISA方法的灵敏度。酶标记后的抗体会和待测物中抗原的不同表位结合形成抗体
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抗原
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抗体的双抗夹心复合物，形成的复合物也被结合在固相载体上，加入酶反应的底物后，底物会被酶催化成有色产物，有色产物颜色的深浅则可以判断待测物中抗原的浓度，从而进行定性或者定量的实验。该方法检测时间较长，检测范围窄。
[0007](2)化学发光免疫分析法(CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。该方法检测精度不高，仪器设备的成本较高。
[0008](3)免疫胶体金方法(ICA)是将高电子密度的胶体金作为标记物标记在抗体或者抗原上，由于胶体金的颜色可直接用肉眼观察，给操作者带来极大的方便，因而可以用以定性或者半定量的检测研究中。随着胶体金研究的发展，在金核的表面可以进行一定的修饰，主要为含硫的配体、含磷化物、磷氧化物、氨基和羧基的配体。该方法灵敏度较低，不能进行定量的检测，达不到临床诊断的要求。

技术实现思路

[0009]本申请实施例的目的在于提出一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，检测的灵敏度和准确性高，且检测耗时短。
[0010]为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，采用了如下所述的技术方案：
[0011]一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，所述试剂盒包括时间分辨荧光试纸，所述时间分辨荧光试纸包括PVC底板、硝酸纤维素膜、时间分辨荧光结合垫、样品垫和吸水纸；
[0012]其中，所述硝酸纤维素膜粘附在所述PVC底板上，所述时间分辨荧光结合垫和吸水纸分别粘附在硝酸纤维素膜的两端，所述样品垫粘附在时间分辨荧光结合垫的远离所述硝酸纤维素膜的一端，所述时间分辨荧光结合垫上固定有荧光微球标记的GP73单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线，其中，所述检测线包被有GP73单克隆抗体，所述质控线包被有鸡IgY抗体。
[0013]进一步的，所述硝酸纤维素膜通过如下步骤制得：
[0014]制备包被缓冲液；
[0015]通过所述包被缓冲液在初始硝酸纤维素膜上分别包被GP73单克隆抗体和鸡IgY抗体，分别作为检测线和质控线，获得所述硝酸纤维素膜。
[0016]进一步的，所述包被缓冲液包括pH为7.4的0.01
‑
0.02M磷酸盐缓冲液和1％的海藻糖。
[0017]进一步的，所述检测线包被的GP73单克隆抗体的浓度为0.8
‑
1.2mg/mL，包被量为1.0μL/cm，所述质控线包被的鸡IgY抗体的浓度为1.0
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1.5mg/mL，包被量为1.0μL/cm。
[0018]进一步的，所述时间分辨荧光结合垫通过如下步骤制得：
[0019]制备荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液；
[0020]等比例混合所述荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液，获得荧光微球标记液；
[0021]将所述荧光微球标记液3
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6μL/cm的喷量均匀喷在初始结合垫上，干燥后获得所述时间分辨荧光结合垫。
[0022]进一步的，所述制备荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液的步骤包括：
[0023]取固含量为1％的时间分辨荧光微球，加入标记缓冲液，混匀后加入标记活化液，离心并去上清，保留沉淀；
[0024]用标记缓冲液超声复溶沉淀，加入目标标记抗体，反应后加入封闭液，离心后，保留沉淀；
[0025]加入标记保存液，超声混匀，获得目标标记溶液；
[0026]其中，在所述目标标记抗体为GP73抗体时，所述目标标记溶液为荧光微球标记的GP73抗体溶液，在所述目标标记抗体为羊抗鸡IgY抗体时，所述目标标记溶液为荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液。
[0027]进一步的，所述样品垫通过如下步骤制得：
[0028]配置样品垫处理液；
[0029]将所述样品垫处理液均匀涂抹于初始样品垫上，干燥后获得所述样品垫。
[0030]进一步的，所述样品垫处理液为PB缓冲液，所述PB缓冲液包括0.5
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1％的牛血清白蛋白、2％的海藻糖和0.05％
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0.1％的吐温20本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括时间分辨荧光试纸，所述时间分辨荧光试纸包括PVC底板、硝酸纤维素膜、时间分辨荧光结合垫、样品垫和吸水纸；其中，所述硝酸纤维素膜粘附在所述PVC底板上，所述时间分辨荧光结合垫和吸水纸分别粘附在硝酸纤维素膜的两端，所述样品垫粘附在时间分辨荧光结合垫的远离所述硝酸纤维素膜的一端，所述时间分辨荧光结合垫上固定有荧光微球标记的GP73单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线，其中，所述检测线包被有GP73单克隆抗体，所述质控线包被有鸡IgY抗体。2.根据权利要求1所述的基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜通过如下步骤制得：制备包被缓冲液；通过所述包被缓冲液在初始硝酸纤维素膜上分别包被GP73单克隆抗体和鸡IgY抗体，分别作为检测线和质控线，获得所述硝酸纤维素膜。3.根据权利要求2所述的基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液包括pH为7.4的0.01
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0.02M磷酸盐缓冲液和1％的海藻糖。4.根据权利要求2所述的基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，其特征在于，所述检测线包被的GP73单克隆抗体的浓度为0.8
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1.2mg/mL，包被量为1.0μL/cm，所述质控线包被的鸡IgY抗体的浓度为1.0
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1.5mg/mL，包被量为1.0μL/cm。5.根据权利要求1所述的基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，其特征在于，所述时间分辨荧光结合垫通过如下步骤制得：制备荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液；等比例混合所述荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液，获得荧光微球标记液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，齐文闯，刘双，潘秀华，何莹，杨晶，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：