本发明专利技术涉及乙型肝炎和其他传染病的免疫治疗，包括免疫细胞治疗和免疫因子治疗，疫苗开发研究的应用。具体涉及诱导模板，诱导方法和传染病，肿瘤等多种疾病的细胞治疗，免疫治疗和疫苗开发等技术领域，且公开了一种乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用的激活测试方法，包括以下步骤：1)动物分组及剂量：实验动物分组方法：雌、雄动物分别按体重进行分层随机分组，共分为3组：阳性对照组4只，细胞治疗小剂量组4只，细胞治疗大剂量组2只，雌雄各半。该乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用的刺激测试方法，该方法没有使用病毒载体基因转录或其他载体基因编辑技术方法，却具有激活抗体分泌B细胞的作用。却具有激活抗体分泌B细胞的作用。却具有激活抗体分泌B细胞的作用。
【技术实现步骤摘要】
一种乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用测试方法
[0001]本专利技术涉及乙型肝炎和其他传染病的免疫治疗，包括免疫细胞治疗和免疫因子治疗，疫苗开发研究的应用。具体涉及诱导模板，诱导方法和传染病，肿瘤等多种疾病的细胞治疗，免疫治疗和疫苗开发等
，具体为一种乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用测试方法。
技术介绍
[0002]随着分子生物学和转基因技术的发展，利用合理的转基因技术，可以定向某些细胞的靶向性，比如，CART治疗肿瘤，只要肿瘤抗原是特异的，理论上就可以获得良好的治疗效果。同样技术也可以用于传染病治疗方法的开发。生物技术的发展为治疗乙肝开辟了广阔的希望。国内外自从90年代，尝试多种生物制剂治疗乙肝，如亚单位治疗性疫苗，基因治疗，细胞免疫治疗等。但是，并未取得突破，直至 2008年，我国经过了三期临床试验的四种治疗性生物制剂，均未达到预期的治疗效果。细胞免疫治疗，大多是以体外经过淋巴因子诱导 DC细胞，尝试打破乙肝患者类似于免疫耐受机制，但是，效果不确切。
[0003]最近，出自于基因编辑技术，是患者自身杀伤性T细胞具有对乙肝病毒的特异性结合和清除能力；iRNA技术研制的旨在抑制乙肝病毒转录过程，从而达到彻底杀灭病毒目的，已经进入临床试验阶段；然而，至今为止，上述疗法都与感染乙肝后的自然免疫清除差距甚远。
[0004]乙肝感染者大多以来自身的免疫系统而自然清除，最关键的标志是能够产生抗乙肝病毒表面抗体，然而，时至今日，并没有在这方面有突破性进展。从过去的细胞免疫治疗实践，以体外激活DC的思路，没有获得理想效果，这与我们对于乙肝发病机制的了解还不透彻，或者没有研究到关节点，至今，没有理想的乙肝动物模型，都有不同的理解。
[0005]免疫治疗在理论上应该是最有效的，目前主要思路就是激活抗病毒相关的免疫细胞，如TC,NK,LAK和B细胞，其中TC,NK和LAK的激活治疗方法已经有20年应用历史，效果不确切，而激活B细胞，产生抗乙肝病毒的保护性抗体，仍然是空白。
技术实现思路
[0006](一)解决的技术问题
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用测试方法，具备更有效的激活B细胞和产生抗乙肝病毒的保护性抗体等优点，解决了上述
技术介绍
中所提到的问题。
[0008](二)技术方案
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种乙肝抗体阳性 B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用测试方法，包括以下步骤：
[0010]1)动物分组及剂量：实验动物分组方法：雌、雄动物分别按体重进行分层随机分
组，共分为3组：阳性对照组4只，细胞治疗小剂量组4只，,细胞治疗大剂量组2只，雌雄各半。
[0011]2)给药相关信息及剂量：给药途径及方法：细胞回输采用静脉注射；给药途径的选择理由：与临床给药途径一致；给药频率及期限：细胞治疗组各只动物均采用单次细胞回输，所有动物乙肝疫苗注射4 次。
[0012]3)剂量设计：因为此细胞治疗方法没有相关参考文献，所以，根据委托方建议的给药剂量，以60公斤体重人体治疗剂量为单次 1x108细胞，推算本实验食蟹猴给药剂量应该为：1.6x106cells/kg，由于是毒理学研究预实验，采用小剂量组相对等于人类单次治疗剂量，大剂量组为小剂量组5倍。
[0013]4)基因诱导淋巴细胞体外培养对HBsAg的清除方法：
[0014]试验方法：体外细胞培养法；细胞来源：细胞治疗组动物；细胞处理：非病毒载体基因诱导；阳性对照：来源于阳性对照组PBMC；阴性对照：来源于细胞治疗组PBMC，未经基因诱导。
[0015]5)自体基因诱导淋巴细胞回输后，血清HBsAb产生情况：
[0016]采血动物：所有动物；采血时间：给药前、首次给药后第2、4 周、8周；采血部位：动物前肢或后肢静脉；采血量及抗凝剂：用惰性分离胶促凝管采集血液约1mL。
[0017]6)外周血T、B淋巴细胞表型测定：采血动物：所有动物；采血时间：给药前、首次免疫后D15和D24；采血部位：动物前肢或后肢静脉；采血量及抗凝剂：用EDTA
·
K2真空采血管采集血液约1mL；样品标识：各样品标有专题编号、动物编号、试验天数、样本类型及采集日期；样品的保存与运输：血液样品在采集后室温放置，于2h 内送免疫部检测。
[0018]优选的，所述在含有乙肝疫苗2ng/ml培养基培养第五天，检测上清中HBsAg滴度，1001号动物基因诱导淋巴细胞在1/16稀释后出现阴性结果，非基因诱导自身淋巴细胞在1/64才转阴性，表3。在含有乙肝疫苗4ng/ml培养基培养第10天，检测上清中HBsAg滴度， 2003号动物基因诱导淋巴细胞在1/256倍稀释时出现阴性孔，1/1024 时完全转阴，而非基因诱导自身淋巴细胞无转阴孔。
[0019]优选的，所述体外基因诱导后的淋巴细胞自体回输后，开始为抑制作用，表现为抗体生成时间延迟，1免疫和2免后血清HBsAb水平低于阳性基因模板供体动物；到3免，4免，基因诱导的淋巴细胞自体回输动物的HBsAb水平呈跳跃式升高，明显高于阳性基因模板供体动物。大剂量组比小剂量组的抑制作用阶段稍强，3免后的HBsAb跳跃式抗体分泌增强作用大小剂量组无明显差异。
[0020]优选的，所述给药前(D0)、及细胞回输后各个时间点比较，T/B 淋巴细胞(CD3/CD4，CD3/CD8和CD20)表型，自身比较和各组比较，除CD3在小剂量组有轻度降低趋势以外，大剂量组无类似变化，总和分析T/B淋巴细胞表型检测结果，各组动物没有明显变化。
[0021]优选的，所述给药相关信息及剂量恢复期：无；给药时间：09： 03～15:49；给药体积：10mL/只；给药速率：3mL/min。
[0022]优选的，所述培养基：淋巴细胞专用培养基，含乙肝疫苗2ng/ml 和4ng/ml；培养条件：50000细胞/孔，复孔，接种96孔板，37℃， 5％CO2，共培养10天。
[0023]优选的，所述样本的保存与运输：血液在采集后放入样品运输箱， 2h内送临检部门检测；测定方法：采用成品ELISA试剂盒，OD值>0.1 为阳性。
[0024]优选的，所述标本采集：分别于D5和D10离心，收集上清；检测指标：HBsAg滴度；检
测方法：采用成品ELISA试剂盒。
[0025]优选的，所述检测指标：外周血T细胞(CD3+)、T细胞亚群 (CD3+CD4+，CD3+CD8+)、B细胞(CD3
‑
CD20+)；检测方法：流式细胞仪。
[0026](三)有益效果
[0027]与现有技术相比，本专利技术提供了一种乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用刺激方法，具备以下有益效果：
[0028]该乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用刺激方法，通过对食蟹猴静脉注射自体基因诱导淋巴细胞后，初本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用刺激测试方法，其特征在于，包括以下步骤：1)动物分组及剂量：实验动物分组方法：雌、雄动物分别按体重进行分层随机分组，共分为3组：阳性对照组4只，细胞治疗小剂量组4只，,细胞治疗大剂量组2只，雌雄各半；2)给药相关信息及剂量：给药途径及方法：细胞回输采用静脉注射；给药途径的选择理由：与临床给药途径一致；给药频率及期限：细胞治疗组各只动物均采用单次细胞回输，所有动物乙肝疫苗注射4次；3)剂量设计：因为此细胞治疗方法没有相关参考文献，所以，根据委托方建议的自体免疫细胞治疗公认给药剂量，以60公斤体重人体治疗剂量为单次1x108细胞，推算本实验食蟹猴给药剂量应该为：1.6x106cells/kg，由于是毒理学研究预实验，采用小剂量组相对等于人类单次治疗剂量，大剂量组为小剂量组5倍；4)基因诱导淋巴细胞体外培养对HBsAg的清除方法：试验方法：体外细胞培养法；细胞来源：细胞治疗组动物；细胞处理：非病毒载体基因诱导；阳性对照：来源于阳性对照组PBMC；阴性对照：来源于细胞治疗组PBMC，未经基因诱导；5)自体基因诱导淋巴细胞回输后，血清HBsAb产生情况：采血动物：所有动物；采血时间：给药前、首次给药后第2、4周、8周；采血部位：动物前肢或后肢静脉；采血量及抗凝剂：用惰性分离胶促凝管采集血液约1mL(结合长期毒性试验血液生化指标测定进行，不单独采集)；6)外周血T、B淋巴细胞表型测定：采血动物：所有动物；采血时间：给药前、首次免疫后D15和D24；采血部位：动物前肢或后肢静脉；采血量及抗凝剂：用EDTA
·
K2真空采血管采集血液约1mL；样品标识：各样品标有专题编号、动物编号、试验天数、样本类型及采集日期；样品的保存与运输：血液样品在采集后室温放置，于2h内送免疫部检测。2.根据权利要求1所述的一种乙肝抗体阳性B细胞对于乙肝疫苗的抗体分泌作用测试方法，其特征在于，所述在含有乙肝疫苗2ng/ml培养基培养第五天，检测上清中HBsAg滴度，1001号动物基因诱导淋巴细胞在1/16稀释后出现阴性结果，非基因诱导自身淋巴细胞在1/64才转阴性，表3；在含有乙肝疫苗4ng/ml培养基培养第10天，检测上清中HBsAg滴度，2003号动物基因诱导淋巴细胞在1/256倍稀释时出现阴性孔，1/1024时完全转阴，而非...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海鹰，
申请(专利权)人：河南道特尔医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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