ALKBH5蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了ALKBH5蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用。本发明专利技术针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，降低DHFR基因的扩增程度，减少细胞内的DMs数量。干扰ALKBH5主要通过抑制(m6A)R

【技术实现步骤摘要】
ALKBH5蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用


[0001]本专利技术涉及ALKBH5蛋白抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，特别涉及ALKBH5蛋白抑制剂在制备通过抑制(m6A)R
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loop的去甲基化修饰而导致降低细胞对DSBs的HR修复能力，下调DHFR基因扩增，进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，本专利技术属于医药


技术介绍

[0002]氨甲蝶呤(Methotrexate，MTX)作为一种抗代谢类抗肿瘤药物，广泛应用于急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、头颈部癌、膀胱癌和肺癌等疾病的治疗。MTX可通过竞争性地抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)活力，使二氢叶酸生成四氢叶酸的合成受损，导致DNA的合成受抑制，最终引起细胞死亡。但部分患者会在MTX治疗过程中产生获得性耐药，导致化疗失败。而MTX的主要靶酶DHFR的活性增高及其基因的扩增是使肿瘤对MTX产生耐药的主要机制之一。
[0003]基因扩增是染色体限制性区域拷贝数的增加，普遍存在于多种肿瘤中。细胞遗传学分析表明，基因扩增主要以染色体上的均质染色区(homogeneously staining regions,HSRs)和染色体外的DMs(double minute chromosomes,DMs)两种形式存在，其所承载的癌基因或耐药基因对肿瘤的进展与耐药具有驱动作用。关于DMs的形成机制主要包括复制叉断裂模型、染色体环出模型、“断裂
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融合r/>‑
桥”模型和“易位
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断裂
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扩增”模型。虽然DMs的形成机制目前还存在较多的争议，但其先决条件是DNA双链的断裂，而双链的断裂损伤后修复会促进DMs产生。DNA双链断裂(double
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strand breaks,DSBs)是一种最严重的DNA损伤，为了维持基因组的完整性和稳定性，生物体进化出完善的DNA损伤应答(DNA damage response，DDR)来修复DNA双链损伤。这一过程是由受影响的细胞触发的、特定的、复杂的、相互关联的信号级联网络，包括感知和传递损伤信号给效应蛋白、阻滞细胞周期、激活DNA修复途径和细胞死亡。
[0004]细胞中主要存在三种DSBs的修复途径，同源重组(homologous recombination，HR)、非同源末端连接(non
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homologous end joining，NHEJ)和选择性非同源末端连接(alternative non
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homologous end joining，A
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EJ)，前期研究已经表明HR、NHEJ、A
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EJ多条修复途径都能促进DMs形成。
[0005]RNA表观遗传学是继DNA表观遗传学后兴起的表观遗传学新研究方向，在哺乳动物中RNA表观遗传修饰可以调控RNA的加工代谢，并调节众多生物学过程。RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60％以上，而N6
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甲基腺嘌呤(N6
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methyladenosine,m6A)是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰。m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，研究表明其功能由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”决定。“编码器(Writer)”即甲基转移酶，目前已知这个复合物的成分有METTL3，METTL14,WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作为去甲基酶(消码器)可逆转甲基化；m6A由m6A结合蛋白识别，目前发现m6A结合蛋白
(读码器)有YTH结构域蛋白(包括YTHDF1,YTHDF2、YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2)和核不均一蛋白HNRNP家族(HNRNPA2B1和HNRNPC)。microRNA、circRNA、rRNA、tRNA和snoRNA上都有发生m6A修饰，然而目前发现METTL3可以催化基因组DNA中R
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loop m6A甲基化修饰，并通过相应的m6A阅读蛋白发挥生物学功能。
[0006]R
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loop是一种三链结构，由一条ssDNA和DNA
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RNA杂交体构成，R
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loop的存在打破了稳定的DNA双链结构进而影响了基因组的稳定性，R
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loop结构广泛存在于基因组中，位于基因启动子、终止子、DSBs等处的R
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loop可以发挥促进基因起始转录、促进基因转录终止、抑制损伤修复等作用。有研究表明在基因间区也存在R
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loop，这类R
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loop位于增强子或超级增强子区，可以促进多个基因的转录。R
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loop主要通过自身稳定性在基因组中发挥功能，R
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loop的稳定性取决于与其结合的蛋白，包括DNA
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RNA解旋酶、核酸酶、m6A修饰相关蛋白、DNA损伤修复蛋白通过降解或稳定R
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loop调节R
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loop的稳定性。顾名思义，解旋酶、核酸酶主要是通过酶活性调控R
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loop稳定性。其中，文献报道还表明基因组DNA的启动子、终止子、基因间区具有m6A修饰位点，而理论上这类DNA不应有m6A修饰位点，因此，基因组DNA中广泛存在的R
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loop可能是m6A修饰作用的靶位点，并且最终通过R
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loop的m6A修饰调控R
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loop稳定性。由于m6A去甲基化修饰因子ALKBH5也是R
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loop的结合蛋白，因此，ALKBH5可能通过催化R
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loop去甲基化修饰调控R
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loop稳定性进而发挥基因转录调控和DNA损伤修复的功能。
[0007]本专利技术发现ALKBH5可以催化(m6A)R
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loop去甲基化修饰，因此以m6A去甲基酶ALKBH5为靶点进行干扰后发现，ALKBH5通过催化(m6A)R
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loop去甲基化修饰调控R
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loop稳定性，进一步促进HR损伤修复应答过程，促进DMs的形成，导致细胞对MTX的耐药性增加。因此，ALKBH5作用的(m6A)R
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loop有望成为治疗MTX耐药肿瘤及其他含基因扩增的肿瘤的新靶点。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于针对肿瘤化疗药物MTX常因在治疗过程中产生耐药而导致化疗失败的现象，提供以ALKBH5所催化的(m6A)R
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loop调控HR修复功能逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的方法。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术专利技术人前期构建了人结肠癌细胞系HT29
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4细胞，其为对MTX的耐受程度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ALKBH5蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性和降低肿瘤细胞恶性生长的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的ALKBH5蛋白抑制剂为在转录水平上抑制ALKBH5蛋白表达的药物。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为含有ALKBH5 shRNA的干扰载体。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的含有ALKBH5 shRNA的干扰载体为含有ALKBH5 shRNA的慢病毒载体。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的ALKBH5 shRNA的序列为SEQ ID NO.1或2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥宁，邢若男，朱静，孙文靖，崔晓波，冀国华，张慧姝，史航，张玫茵，宋甜甜，刘荧灿，季家政，刘扬和，邢舒凯，李思青，吴威，陈锌，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：