CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量中的应用，通过原核表达和纯化绵羊CSTB重组蛋白，将其添加至绵羊卵母细胞体外成熟液中，成熟后的卵母细胞进行体外受精和体外培养，第24h统计卵裂率，第7d统计囊胚率，本发明专利技术应用CSTB重组蛋白提高绵羊卵母细胞的质量，表现为提高了卵裂率以及囊胚率，CSTB重组蛋白可用于绵羊卵母细胞体外高效利用，具有在胚胎工程上推广应用价值。具有在胚胎工程上推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量中的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体为CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量中的应用。

技术介绍

[0002]半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)广泛分布于动植物体内，它参与各种生理和病理过程，如蛋白质的分解代谢、感染与免疫、肿瘤的侵袭和转移等过程。在对体内蛋白酶活性调控、胞外基质的改变、细胞分化、细胞迁移、蛋白折叠等多个方面起非常重要的作用。半胱氨酸蛋白酶抑制剂为半胱氨酸蛋白酶可逆竞争性内源抑制剂超家族。半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子的特征是能等摩尔与半胱氨酸蛋白酶分子发生紧密、可逆地结合，抑制蛋白酶的活性。半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(CSTB)，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一，含98个氨基酸，位于细胞质、线粒体和细胞核中。CSTB基因突变可引起进行性肌阵挛性癫痫1型(EPM1)疾病。敲除胱氨酸抑素B基因会产生大多数EPM1症状；小胶质细胞活化、氧化应激和神经炎症，突触传递障碍等症状，其寡聚物可与细胞骨架蛋白相互作用，具有伴侣样功能等功能。但目前尚未见到CSTB对卵母细胞质量方面影响的相关报道。
[0003]卵母细胞的质量受内源性胱氨酸蛋白酶活性的影响，通常胱氨酸蛋白酶活性高的卵母细胞内质量低，发育能力差，利用化学合成的外源性蛋白酶抑制剂可提高卵母细胞的质量，尚未见到细胞内源性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B对卵母细胞质量的影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量的试剂中的应用。
[0006]优选的，所述绵羊卵母细胞体外成熟卵母细胞，且绵羊卵母细胞包括GV期、MI期和MII期的绵羊卵母细胞。
[0007]优选的，重组CSTB蛋白的制备如下：将已构建好的含有表达CSTB基因的质粒pET28a
‑
CSTB转化大肠杆菌BL21，阳性克隆菌在IPTG诱导下表达重组蛋白，经SDS
‑
PAGE分析表明重组蛋白CSTB在BL21菌中以可溶形式高效表达；表达重组蛋白菌体在含蛋白酶抑制剂TE溶液中经冰浴超声破碎裂解，10000rpm离心10min，取上清，经Ni
‑
NTA亲和层析纯化，洗脱缓冲液洗脱重组蛋白，超滤去除咪唑，然后换成TGE缓冲液再次超滤并保存蛋白，其中所述的TGE缓冲液配比为50mM Tris
‑
HCl、0.5mM EDTA、50mM NaCl以及5％甘油，并调整pH值为8.0；纯化后的His
‑
CSTB经过SDS
‑
PAGE鉴定为重组CSTB蛋白,经活性检测具有抑制半胱氨酸蛋白酶的活性。
[0008]优选的，绵羊卵母细胞体外胚胎生产步骤如下：
[0009]步骤一：获取当日宰杀绵羊的卵巢，置入温度在30
‑
35℃，含1000IU/ml青霉素和
1000IU/mL链霉素的生理盐水中，3
‑
5小时内带回实验室，用生理盐水清洗3
‑
4次；
[0010]步骤二：用吸有1mL抽卵液的注射器抽吸卵巢表面1
‑
5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3
‑
5次，加入到添加了重组CSTB蛋白的体外成熟液中，在条件为5％ CO2，95％空气，温度为38.6℃的CO2培养箱内培养22
‑
24h；
[0011]步骤三：将步骤二中得到的卵母细胞，用绵羊体外受精液洗涤2
‑
4次，按25
‑
30枚/滴的密度加入装有体外受精(IVF)液的液滴内，备用；
[0012]步骤四：将解冻后的冻精，加入装有IVF液的试管底部，CO2培养箱中上游20
‑
25min，取上层精子混悬液，以1500rpm的转速离心4
‑
5min，然后弃去上清液，用剩余的精子按2
‑4×
106个/mL的密度加入步骤三的IVF液滴中与卵母细胞共同孵育；
[0013]步骤五：将步骤四中受精20
‑
22h的早期胚胎取出，在体外培养液(IVC)内洗涤3
‑
4次，并在IVC液中培养24
‑
26小时，将未卵裂的卵母细胞挑出，统计卵裂率，继续培养7d后统计囊胚率。
[0014]优选的，CSTB重组蛋白氨基酸序列如下：
[0015]MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSMCGAPSATQPATAETQAI ADKVKSQLEEKENKKFPVFKALEFKSQLVAGKNYFIKVQVDEDDFVHIRVFESLPH ENKPVALTSYQTNKGRHDELTYF。
[0016]优选的，CSTB重组蛋白在体外成熟液中的浓度为100
‑
150ng/ul。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0018]本专利技术应用CSTB重组蛋白在绵羊卵母细胞体外成熟阶段的处理，可提高了绵羊卵母细胞的质量以及体外发育能力，且CSTB重组蛋白可以作为新型的绵羊卵母细胞减数分裂抑制剂药物在家畜胚胎工程上推广应用，同时，CSTB重组蛋白为体内存在的蛋白多肽类物质，对绵羊卵母细胞的毒害作用小。
具体实施方式
[0019]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量的试剂中的应用。
[0021]根据CSTB重组蛋白氨基酸序列：
[0022]MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSMCGAPSATQPATAETQAI ADKVKSQLEEKENKKFPVFKALEFKSQLVAGKNYFIKVQVDEDDFVHIRVFESLPH ENKPVALTSYQTNKGRHDELTYF，其中重组蛋白第35
‑
131位氨基酸为绵羊CSTB序列。
[0023]重组CSTB蛋白的制备过程如下：
[0024]将绵羊CSTB(Genbank ID:XM_027960962.2)基因cDNA开放阅读框序列克隆至质粒pET28a的BamHI，HindIII之间，将构建好的质粒pET28a
‑
CSTB转化大肠杆菌BL21，阳性克隆菌在IPTG诱导下表达重组蛋白，经SDS
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PAGE分析表明重组蛋白CSTB在BL21菌中以可溶形式高效表达；表达重组蛋白菌体在含蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量中的应用，其特征在于：所述CSTB重组蛋白氨基酸序列如下：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSMCGAPSATQPATAETQAIADKV KSQLEEKENKKFPVFKALEFKSQLVAGKNYFIKVQVDEDDFVHIRVFESLPHENKPVAL TSYQTNKGRHDELTYF。2.根据权利要求1所述的CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量中的应用，其特征在于：所述CSTB重组蛋白的浓度为在体外成熟液中的浓度为100
‑
150ng/ul。3.根据权利要求1所述的CSTB重组蛋白在促进绵羊卵母细胞质量中的应用，该方法包括步骤如下：步骤一：获取当日宰杀绵羊的卵巢，置入温度在30
‑
35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/mL链霉素的生理盐水中，3
‑
5小时内带回实验室，用生理盐水清洗3
‑
4次；步骤二：用吸有1mL抽卵液的注射器抽吸卵巢表面1
‑
5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3
‑
5次，加入到添加了重组CSTB蛋白的体外成熟液中，在条件为5％CO2，95％空气，温度为38.6℃的CO2培养箱内培养22
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24h；步骤三：将步骤二中得到的卵母细胞，用绵羊体外受精液洗涤2
‑
4次，按25
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30枚/滴的密度加入装有体外受精(IVF)液的液滴内，备用；步骤四：将解冻后的冻精，加入装有IVF液的试管底部，CO2培养箱中上游20
‑
25min，取上层精子混悬液，以1500rpm的转速离心4
‑
5min，然后弃去上清液，用剩余的精子按2
‑4×
106个/mL的密度加入步骤三的IVF液滴中与卵母细胞共同孵育；步骤五：将步骤四中受精20
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22h的早期胚胎取出，在体外培养液(IVC)内洗涤3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴阳升，林嘉鹏，陈莹，汪立芹，黄俊成，吴伟伟，汪建国，岳涛，李杰，梁红艳，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院生物技术研究所新疆畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心，
类型：发明
国别省市：