一种用于猪卵母细胞体外成熟三维培养的试剂组合物和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于猪卵母细胞体外成熟三维培养的试剂组合物和方法，所述试剂组合物包括海藻酸盐溶液、钙离子交联液、卵母细胞体外成熟基础液、卵母细胞体外成熟液、海藻酸盐裂解酶、透明质酸酶；所述海藻酸盐溶液的配置介质为PBS缓冲液。本发明专利技术通过海藻酸盐水凝胶包埋猪卵母细胞，建立了猪卵母细胞体外成熟三维培养体系，适当浓度的Ca

【技术实现步骤摘要】
一种用于猪卵母细胞体外成熟三维培养的试剂组合物和方法


[0001]本专利技术属于胚胎工程中的卵母细胞体外成熟培养
，更具体地，涉及一种用于猪卵母细胞体外成熟三维培养的试剂组合物和方法。

技术介绍

[0002]卵母细胞体外成熟(in vitro maturation，IVM)是一种基于传统的体外受精改良的辅助生殖技术，即在少量或无外源性促性腺激素的刺激下，从窦卵泡中取出生发泡期(GV，Germinal vesicle)未成熟卵母细胞，在体外自发成熟为MII期卵母细胞的过程。IVM是体外胚胎产生的关键环节，它决定着卵母细胞的质量，影响着胚胎的发育。卵母细胞IVM是一个复杂的过程，受促性腺激素、分泌因子、卵母细胞状态以及卵母细胞与卵丘细胞相互作用等调节因素的影响。卵母细胞从生发泡期到第二次减数分裂中期(MII期)的体外培养涉及一系列细胞核和细胞质成熟事件，对受精和早期胚胎发育至关重要。IVM卵母细胞的发育能力仍然不及体内成熟的卵母细胞，科学家试图探索不同的培养基添加剂，如激素、生长因子等，以期望获得更高的卵母细胞成熟率。但是，猪等一些大型家畜的卵母细胞体外受精效率仍然较低，说明猪卵母细胞体外成熟系统还不完善，有待进一步优化。
[0003]卵母细胞的核成熟和细胞质成熟是卵母细胞完全成熟的两个必须条件，是卵母细胞可以实现受精的关键。核成熟通常伴随着核膜破裂(Germinal vesicle breakdown，GVBD)以及第一极体的排出。在此过程当中，卵母细胞的细胞质也逐渐达到成熟，即线粒体含量逐渐增加，皮质颗粒从细胞质区迁移到皮质层，最终全部迁移到皮质下层。因此，线粒体和皮质颗粒的含量与分布是卵母细胞细胞质成熟的标志。细胞核和细胞质同步成熟是卵母细胞受精的必要条件。在体内，卵母细胞具有一套完整的核成熟抑制机制，即通过抑制核成熟达到核质成熟同步。而IVM的卵母细胞缺乏核成熟的抑制机制，卵母细胞的核与细胞质成熟往往不同步，即细胞核先成熟，细胞质后成熟，影响了卵母细胞的正常受精，导致受精后胚胎的分裂率和囊胚率较低。因此，如何促进卵母细胞核细胞质的成熟同步一直是人们关注的问题。
[0004]目前提高卵母细胞的成熟方式较为单一，主要为改良成熟液的配方(例如专利CN 110760473 B)，所以寻找一种新的方式至关重要。三维培养是近几年发展起来的一种新的细胞培养技术，优势在于该技术可以通过模拟细胞之间及细胞外基质信号传导的微环境，使细胞培养的状态更接近于生物体内；并将细胞培养在三维结构的载体中，使细胞能够在载体的空间结构中增殖和分化，构成细胞－载体复合物，进而提升细胞在体外存活率与存活状态。专利CN112899219A公开了一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法，其培养对象为卵泡，专利CN113774016A公开了一种卵母细胞体外成熟3D培养体系，然而上述三维培养体系和方法针对的主要是鼠类或低级哺乳动物，不适用于猪等大型哺乳动物，如何将三维培养技术应用在猪卵母细胞IVM的过程中以提高其体外成熟质量仍然存在很大问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于猪卵母细胞体外成熟三维培养的试剂组合物。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供所述试剂组合物在构建提高猪卵母细胞体外成熟质量的三维培养体系中的应用。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供一种提高猪卵母细胞体外成熟质量的三维培养方法。
[0008]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0009]一种用于猪卵母细胞体外成熟三维培养的试剂组合物，其特征在于，包括海藻酸盐溶液、钙离子交联液、卵母细胞体外成熟基础液、卵母细胞体外成熟液、海藻酸盐裂解酶、透明质酸酶；所述海藻酸盐溶液的配置介质为PBS缓冲液(即海藻酸盐的PBS溶液)。
[0010]本专利技术提供的上述试剂组合物中，海藻酸盐为基质，以特定的PBS作为介质配置的海藻酸盐溶液通过与钙离子交联液进行交联，形成的海藻酸盐凝胶为猪卵母细胞发育提供立体结构；卵母细胞体外成熟基础液用于保存从卵巢中收集得到的猪卵母细胞，并用清洗液清洗多余的交联液；卵母细胞体外成熟液用作海藻酸盐凝胶包封后的猪卵母细胞体外成熟的培养液；海藻酸盐裂解酶用于对包封的猪卵母细胞海藻酸盐凝胶进行解交联，以取出猪卵母细胞；透明质酸酶用于脱去体外成熟培养后的猪卵母细胞中扩散的卵丘细胞，从而获得体外成熟的猪卵母细胞用于后续试验。
[0011]所述卵母细胞体外成熟基础液为现有猪卵母细胞体外成熟技术中常规使用的体外成熟基础液即可。所述卵母细胞体外成熟液为现有猪卵母细胞体外成熟技术常规使用的体外成熟液即可。
[0012]优选地，所述海藻酸盐溶液的浓度为0.25～1.5w/v％。
[0013]进一步优选地，所述海藻酸盐溶液的浓度为0.25w/v％。
[0014]优选地，所述海藻酸盐包括但不限于海藻酸钠、海藻酸钾。
[0015]优选地，所述钙离子交联液为CaCl2交联液。
[0016]进一步优选地，所述CaCl2浓度为50～120mM。
[0017]更优选地，CaCl2浓度为50mM。
[0018]优选地，所述钙离子交联液中还含有NaCl和HEPES。其中NaCl可以更好的调节细胞内外渗透压的，HEPES可以作为一种缓冲剂，维持溶液pH的稳定，更利于后期的卵母细胞体外成熟与胚胎发育。
[0019]优选地，所述试剂组合物还包括卵母细胞清洗液，用于在卵母细胞收集作为承载卵泡液的介质，或用于后续体外培养胚胎时清洗胚胎。
[0020]优选地，所述试剂组合物还包括卵母细胞体外培养液、离子霉素、卵母细胞体外培养基础液和6
‑
DMAP，上述试剂主要用于将经三维培养获得的体外成熟后的猪卵母细胞进行体外培养胚胎。
[0021]本专利技术还提供上述任一所述试剂组合物在构建提高猪卵母细胞体外成熟质量的三维培养体系中的应用。
[0022]本专利技术还提供利用上述任一所述试剂组合以提高猪卵母细胞体外成熟质量的三维培养方法，包括如下步骤：
[0023]S1.卵母细胞收集：从猪卵巢的卵泡中收集胞质完整并有卵丘包裹的猪卵母细胞置于卵母细胞体外成熟基础液中；
[0024]S2.卵母细胞封装：将步骤S1收集的猪卵母细胞在海藻酸盐溶液中进行封装，再将封装后的液滴移到钙离子交联液中进行交联，交联后将凝胶滴转入卵母细胞体外成熟基础液中清洗多余的交联液，然后将凝胶滴移入平衡好的成熟盘，再封上矿物油；
[0025]S3.收集成熟卵母细胞：将步骤S2封装猪卵母细胞的凝胶滴在38～39℃，4～6％CO2条件下于卵母细胞成熟液中成熟42～44h，然后将凝胶滴移入海藻酸盐裂解酶中解交联，取出猪卵母细胞，再将猪卵母细胞移入到透明质酸酶中脱去扩散的卵丘细胞，获得体外成熟的猪卵母细胞。
[0026]本专利技术所述三维培养方法中的三维培养体系以海藻酸盐凝胶为基质，以特定配置介质的海藻酸盐与钙离子交联液进行交联，形成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于猪卵母细胞体外成熟三维培养的试剂组合物，其特征在于，包括海藻酸盐溶液、钙离子交联液、卵母细胞体外成熟基础液、卵母细胞体外成熟液、海藻酸盐裂解酶、透明质酸酶；所述海藻酸盐溶液的配置介质为PBS缓冲液。2.根据权利要求1所述试剂组合物，其特征在于，所述海藻酸盐溶液的浓度为0.25～1.5w/v％。3.根据权利要求2所述试剂组合物，其特征在于，所述海藻酸盐溶液的浓度为0.25w/v％。4.根据权利要求1所述试剂组合物，其特征在于，所述海藻酸盐为海藻酸钠。5.根据权利要求1所述试剂组合物，其特征在于，所述钙离子交联液中Ca
2+
浓度为50～120mM。6.根据权利要求5所述试剂组合物，其特征在于，所述钙离子交联液中Ca
2+
浓度为50mM。7.权利要求1～6任一项所述试剂组合物在构建提高猪卵母细胞体外成熟质量的三维培养体系中的应用。8.一种提高猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：石德顺，邱鹏，罗婵，吕美云，王垒，邓彦飞，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：