提高卵母细胞体外成熟率的培养基及其应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，尤其涉及提高卵母细胞体外成熟率的培养基及其应用。本发明专利技术提供的一种使用价格低廉药物替代激素的卵母细胞体外成熟培养液，其含有工作浓度为1.2μM的他喹莫德(Tasquinimod)。利用本发明专利技术提供的培养基能够在体外高效获得优质成熟卵母细胞，大大降低培养成本，能够在哺乳动物卵母细胞体外成熟生产中推广使用，为人类辅助生殖、畜牧业生产、胚胎工程以及异种器官移植研究等提供大量优质成熟卵母细胞。提供大量优质成熟卵母细胞。

【技术实现步骤摘要】
提高卵母细胞体外成熟率的培养基及其应用
[0001]本申请要求于2022年12月28日提交中国专利局、申请号为202211697302.X、专利技术名称为“提高卵母细胞体外成熟率的培养基及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0002]本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及提高卵母细胞体外成熟率的培养基及其应用。

技术介绍

[0003]卵母细胞的体外成熟是指从家畜或人卵巢获取卵母细胞，在一定的培养条件下，模拟卵巢卵泡内部卵母细胞生长发育的生理生化环境，使卵母细胞恢复减数分裂，发育成熟的技术。多年来许多学者进行了卵母细胞体外成熟培养的研究。随着啮齿类动物及大动物如奶牛胚胎移植的产业化发展，体外胚胎生产及相关技术研究极大地促进了人类对于哺乳动物胚胎学及发育学的认识。有学者指出卵母细胞体外培养体系中不但需要一些因子的添加，更需要利用颗粒细胞在卵母细胞成熟过程中发挥功能。目前，虽然卵母细胞的体外成熟技术在医学临床、畜牧生产和科学研究中被广泛应用，但是与体内卵巢卵泡内自然成熟的卵母细胞相比较，其生产的成熟卵母细胞的质量和发育潜力仍有较大进步空间，说明体外成熟培养的卵母细胞有可能只是达到了减数分裂的恢复和细胞核的成熟，但是这并不能代表卵母细胞的完全成熟。
[0004]卵母细胞在体外成熟过程中的退化以及细胞质的不完全成熟是造成体外受精胚胎生产效率低下的主要原因，所以对卵母细胞体外成熟培养体系的研究是不可缺少的。近年来关于卵母细胞的成熟培养(IVM)方法有较大进展。新的可提高卵母细胞体外成熟的方法或培养液不断涌现，并促进了卵母细胞体外生长成熟及其减数分裂能力，提高了体外培养卵母细胞的发育潜力。但是，大多数培养体系中都必须添加促性腺激素，即促卵泡激素(FSH)和促黄体激素(LH)。这导致因所采购的激素的生物学效价存在差异且价格昂贵而拉高了通过胚胎工程技术工厂化生产家畜胚胎的经济成本。当前，亟需解决如何在提高卵母细胞的体外成熟质量的同时减少生产成本的问题。
[0005]他喹莫德(Tasquinimod)是一种通过变构抑制HDAC4活性而发挥作用的药物，具有抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤作用，还可用于治疗自身免疫疾病和病理炎症性疾病。前期临床研究发现，他喹莫德对于前列腺癌具有较好的疗效和安全性，但目前还没有他喹莫德在细胞培养领域的研究。因此，挖掘他喹莫德对于哺乳动物卵母细胞体外成熟的促进作用对于体外胚胎生产及相关技术研究具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种提高卵母细胞体外成熟率的培养基及其应用。本专利技术提供了添加他喹莫德(Tasquinimod，CAS号:254964
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8)和促卵泡
激素的促进卵母细胞体外成熟的培养基，能提高卵母细胞体外成熟的质量。
[0007]本专利技术提供了他喹莫德在制备促进卵母细胞体外成熟的产品中的应用。
[0008]他喹莫德是一种通过变构抑制HDAC4活性发挥作用的药物。本专利技术通过实验发现他喹莫德通过干预卵泡颗粒细胞内HDAC4的活性来有效促进卵母细胞成熟，主要体现在促进颗粒细胞对EGF样因子的表达和分泌，从而促进与其共孵育的卵母细胞的体外成熟比率。所述卵母细胞为哺乳动物的卵母细胞，所述哺乳动物包括但不限于偶蹄目动物、食肉目动物、啮齿类动物或灵长类动物。本专利技术中，所述哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、鹿、驴、骆驼、狗、猫、兔、鼠、猴或人。本专利技术实施例中，以偶蹄目动物牛和猪为实验动物，证明他喹莫德对偶蹄目动物卵母细胞的体外成熟存在促进作用。
[0009]本专利技术提供了一种组合物，包括他喹莫德、表皮生长因子和促卵泡激素。
[0010]进一步地，所述他喹莫德的浓度为600nmol/L～10μmol/L，表皮生长因子的工作浓度为10ng/mL，促卵泡激素的工作浓度为10ng/mL。
[0011]具体的，在一些实施例中，所述他喹莫德的工作浓度为1.2μmol/L。
[0012]本专利技术所述的由他喹莫德、表皮生长因子和促卵泡激素组成的组合物，在合适的剂量范围内联合使用可以促进卵泡体细胞在体外的增殖分化及卵母细胞的成熟。
[0013]本专利技术提供了促进卵母细胞体外成熟的培养基，其包括他喹莫德或本专利技术所述组合物；
[0014]进一步地，所述他喹莫德的浓度为600nmol/L～10μmol/L；
[0015]在所述组合物中，他喹莫德的浓度为1.2μmol/L，表皮生长因子的浓度为10ng/mL，所述促卵泡激素的浓度为10ng/mL。
[0016]具体的，在一些实施例中，本专利技术通过试验设置浓度梯度筛选添加他喹莫德的最适浓度。结果表明，添加1.2μM他喹莫德时，卵丘扩张能力与对照组相比并无显著差异，COCs获得了与正常培养液组相类似的卵母细胞成熟率，因此确定1.2μM为他喹莫德的最佳浓度。
[0017]更进一步地，本专利技术所述培养基还包括基础培养基，所述基础培养基为商品化M199哺乳动物细胞培养基。在一些具体实施例中，所述培养基为液体培养基，其中包括商品化M199培养基、葡萄糖、丙酮酸钠、聚乙烯醇、无机盐、氨基酸和抗生素；
[0018]在一个实施例中，所述培养基中各组分的工作浓度分别为：每50mL所述培养基包括水和商品化M199培养基0.475g、葡萄糖0.0275g、丙酮酸钠0.005g、聚乙烯醇0.05g、无机盐0.11g、氨基酸0.0035g、抗生素0.005g。
[0019]具体的，在一些实施例中，所述无机盐为碳酸氢钠，所述氨基酸为半胱氨酸，所述抗生素为链霉素。
[0020]本专利技术还提供了体外培养卵母细胞的方法，其步骤包括将卵泡中的COCs用PBS缓冲液清洗之后转移至本专利技术所述的培养基中培养至成熟；
[0021]进一步地，所述PBS缓冲液中添加有胎牛血清，所述胎牛血清的添加量为PBS缓冲液总体积的3％。
[0022]利用本专利技术所述的体外培养卵母细胞的方法，能够在体外高效获得优质成熟的哺乳动物卵母细胞，特别是偶蹄目哺乳动物，大大降低培养成本，也降低了大规模应用时的生产成本。
[0023]本专利技术提供的提高卵母细胞体外成熟率的培养基，其添加的他喹莫德能通过干预
卵泡颗粒细胞内的HDAC4的活性从而促进哺乳动物尤其是偶蹄目动物的卵母细胞体外成熟，并且能够提高卵裂率、维持卵裂后早期胚胎发育到囊胚后的内细胞团的细胞数。此外，他喹莫德作为治疗疾病的小分子药物，其价格低廉，具有安全性，可代替价格高昂的促黄体激素。
附图说明
[0024]图1示猪卵丘细胞
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卵母细胞复合体(COCs)经不同浓度他喹莫德体外培养后的卵丘扩张结果，以及卵母细胞第一极体排出率的统计图；
[0025]图2示颗粒细胞经不同条件培养后，细胞中HDAC4的表达特点；
[0026]图3示他喹莫德处理颗粒细胞后，细胞中EGF样生长因子的表达特点；
[0027]图4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.他喹莫德在制备促进卵母细胞体外成熟的产品中的应用。2.一种组合物，其特征在于，其包括他喹莫德、表皮生长因子和促卵泡激素。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述他喹莫德的浓度为600nmol/L～10μmol/L，表皮生长因子的工作浓度为10ng/mL,促卵泡激素的工作浓度为10ng/mL。4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述他喹莫德的工作浓度为1.2μmol/L。5.促进卵母细胞体外成熟的培养基，其特征在于，其包括他喹莫德或权利要求2～4所述的组合物。6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，其还包括商品化M199培养基、葡萄糖、丙酮酸钠、聚乙烯醇、无机盐、氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：王超，夏国良，左真子，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：