一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用，属于干细胞培养技术领域。本发明专利技术的鸡卵原干细胞的体外分离培养方法包括以下步骤：将成年鸡卵巢的皮质部分破碎成组织团块，用包含双抗的PBS缓冲液漂洗，静置后得到下层的组织团；用胰酶消化处理组织团，用磁珠活化细胞分选缓冲液进行重悬，加入一抗，孵育10

【技术实现步骤摘要】
一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，具体涉及一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用。

技术介绍

[0002]女性的生殖衰老与卵巢功能的丧失密切相关，卵母细胞数量和质量的减少是女性生殖衰老的标志性特征。现已有大量研究支持雌性生殖系干细胞(即为卵原干细胞(OSCs))仍然具有再生潜力，其在出生后的卵巢中支持卵母细胞的更新(Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary.Nature；Location and characterization of female germline stem cells(FGSCs)in juvenile porcine ovary.Cell Proliferation)，这为治疗女性不孕症以及减缓卵巢老化开辟了新的有效途径。
[0003]生殖是一切生命体的基本特征之一，物种的延续必须依赖于生殖，而生殖细胞是直接执行该生物学功能的细胞。传统发育学观点认为，雌性动物的成年卵巢内不存在卵原干细胞(On regenerating the ovary and generating controversy.Cell)。随着分子生物学发展，2009年吴际教授团队首次从新生和成年的小鼠卵巢内分离出卵原干细胞并对其生物学特性进行表征(Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries.Nature Cell Biology)，从而证实在成年哺乳动物卵巢中存在卵原干细胞。并利用卵原干细胞成功构建基因修饰动物模型，后通过在小鼠卵巢内追踪移植后的卵原干细胞的发育情况，发现长期培养的卵原干细胞在移植到受体的卵巢后，仍保持了其产生功能性卵母细胞和可育后代的能力。此后，研究人员在人、猪、羊、牛和兔等的卵巢组织中，都发现了卵原干细胞的标志性基因和蛋白的表达，同时这些卵巢生殖干细胞能够在体外培养条件下形成克隆并保持正常核型(In vitro differentiation of human oocyte
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like cells from oogonial stem cells:Single
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cell isolation and molecular characterization.Human Reproduction；Characteristics of Female Germline Stem Cells from Porcine Ovaries at Sexual Maturity.Cell Transplantation；Further characterization of adult sheep ovarian stem cells and their involvement in neo
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oogenesis and follicle assembly.Journal of Ovarian Research；Bovine ovarian stem cells differentiate into germ cells and oocyte
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like structures after culture in vitro.Reproduction in Domestic Animals；Detection,characterization,and spontaneous differentiation in vitro of very small embryoniclike putative stem cells in adult mammalian ovary.Stem Cells and Development)。这些结果表明在哺乳动物中已经成功建立了较完善的卵原干细胞体外分离培养系统，并且可支撑其分化成为功能性的卵母细胞，为不孕不育及相关疾病诊治和生育力保存提供技术平台和理论依据，也为卵原干细胞的临床应用奠定基础。
[0004]按传统发育学观点，鸡出生后原始卵泡库和卵母细胞的数目也已经固定不再增加
(Actions of anti
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M
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llerian hormone on the ovarian transcriptome to inhibit primordial to primary follicle transition.Reproduction)。但随着生物技术的高速发展，在物种进化中占重要地位的鸟类，畜禽中重要的经济动物鸡，是否跟以上报道的哺乳动物一样，成年卵巢中依然存在着少量卵原干细胞，以及这种细胞该如何进行分离纯化，体外扩繁和功能鉴定，目前尚无任何相关报道。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用。本专利技术开创性的从成年鸡卵巢中体外分离培养得到鸡卵原干细胞，能够为延长鸡的产蛋周期、提高鸡的繁殖性能提供新的思路的途径。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种鸡卵原干细胞的体外分离培养方法，包括以下步骤：
[0008](1)将成年鸡卵巢的皮质部分破碎成组织团块，用包含双抗的PBS缓冲液漂洗，静置后得到下层的组织团；用0.25％胰酶消化处理组织团，将消化处理后的组织团用磁珠活化细胞分选缓冲液进行重悬，加入一抗，孵育10
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20min；然后再加入Anti
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mouse IgM二抗磁珠，共孵育20
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30min；用磁珠活化细胞分选缓冲液进行洗脱，即去除未结合磁珠的阴性细胞，洗脱步骤至少重复3次，收集包含目的细胞的洗脱液。将最后的与磁珠结合的目的细胞使用基础培养液重悬，平铺在鸡胚成纤维细胞饲养层上进行培养。
[0009](2)将包含目的细胞的洗脱液依次进行原代培养、传代培养，即体外分离培养得到鸡卵原干细胞。
[0010]优选的，步骤(1)中，所述包含双抗的PBS缓冲液中含有的双抗为1Xantibiotic
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antimycotic(抗生
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抗真菌剂)。
[0011]优选的，步骤(1)中，所述一抗为阶段特异性胚胎抗原
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1(SSEA
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1)。
[0012]优选的，步骤(1)中，所述磁珠活化细胞分选缓冲液为1％(体积分数)胎牛血清和2mM EDTA的D
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PBS缓冲液。
[0013]优选的，步骤(2)中，所述原代培养是以鸡胚成纤维细胞作为饲养层；以包含体积分数为2.5％鸡血清、体积分数为7.5％胎牛血清、1.2mM丙酮酸钠、1Xantibiotic
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antimycotic、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡卵原干细胞的体外分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将成年鸡卵巢的皮质部分破碎成组织团块，用包含双抗的PBS缓冲液漂洗，静置后得到下层的组织团；用胰酶消化处理组织团，将消化处理后的组织团用磁珠活化细胞分选缓冲液进行重悬，加入一抗，孵育10
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20min；然后再加入Anti
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mouse IgM二抗磁珠，共孵育20
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30min；用磁珠活化细胞分选缓冲液进行洗脱，收集包含目的细胞的洗脱液；(2)将包含目的细胞的洗脱液依次进行原代培养、传代培养，即体外分离培养得到鸡卵原干细胞。2.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述包含双抗的PBS缓冲液中含有的双抗为1X antibiotic
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antimycotic(抗生素
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抗真菌剂)。3.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一抗为阶段特异性胚胎抗原
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1。4.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磁珠活化细胞分选缓冲液为含有1％(体积分数)胎牛血清和2mM EDTA的D
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PBS缓冲液。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱桂玉，孟璐，马玉晓，张允，王续钊，姜运良，李显耀，王恒，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：