一种流感-大流行流感二价联合疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种能大量生产制备高效且低成本的流感－大流行流感二价联合疫苗及其制备方法，包括流感全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗和大流行流感裂解疫苗的制备方法，并涉及一种新型流感－大流行流感注射用疫苗制剂及其制备工艺，包括毒种库的制备，疫苗原液生产与制备。本发明专利技术提供的流感－大流行流感二价联合疫苗制剂包含流感和禽流感两种抗原，可同时方便的预防流感和禽流感两种病毒性传染病，防止两种病的暴发流行。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，具体是涉及一种联合疫苗及其制备方 法，特别是指一种流感-大流行流感联合疫苗及其制备方法。
技术介绍
流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三个型的流感病毒(influenzavirus)分别引起的急性呼吸道传染病。甲型流感的流行通 常会引起世界性的流感大流行，并能在家畜和家禽中引起流感流行； 乙型常会引起流感局部爆发，但不引起世界性流感大流行；丙型以散 发病例形式出现，主要侵袭婴幼儿， 一般不引起流感流行。流感在流 行病学上的特点是突然爆发，迅速蔓延，波及面广，发病率高，在年 迈体衰和慢性病患者中死亡率较高。其流行具有一定的季节性，在温、 寒带地区，通常在冬春季流行，但在热带和亚热带地区，则任何季节 都可流行。流感患者是流感的主要传染源，人感染后的潜伏期为1 3 天，从潜伏期末到发病的急性期(约7天)都有传染性。婴幼儿和年 老者常易从单纯型转为肺炎型，少数则损害全身血液系统和神经系 统，出现脑炎症状而呈中毒型。近百年已经出现了5次世界性流感大 流行，给人类造成了大量人员死亡与财产损失。我国用于预防流感的 三种疫苗均为灭活疫苗，均含有流行的甲l、甲3及乙型3种流感病 毒抗原成分；三种灭活疫苗分别为全病毒灭活苗、裂解疫苗和亚单位 疫苗。禽流感(AvianinfluenzaAI)是由甲型动物流感病毒引起的一种 严重危害养禽业的高度传染性、致死性疾病。自1997年起， 一种新 的H5N1亚型高致病性禽流感病毒在全世界范围内蔓延，并且突破种 间屏障向人类传播。截至2007年5月26日，全世界确诊的H5N1亚 型禽流感感染人数已达307人，死亡186人，死亡率高达60.6%。虽 然目前尚无证据表明这种病毒获得了"人传人"的能力，但近年来禽4类H5N1亚型流感在全球范围内的不断爆发，使用高致病性禽流感病 毒与人流感病毒重组的空间空前加大， 一旦这种病毒发生变异、重组 而获得人与人之间传播的能力，将会引起人禽流感大流行，届时将导 致上千万人死亡。人禽流感已成为人类潜在威胁之一。目前禽流感病 毒跨种传播的机制还不十分清楚，但由于高致病性禽流感具有较高的 死亡率，临床上治愈可能性比较小，而人体对这种新的病毒又不具有 免疫力，所以一旦这种病毒获得了人与人之间传播的能力，将引发一 场流感的大流行，世界卫生组织专家警告，这将比SARS更可怕，可 能会导致上千万人死亡。高致病性禽流感己成为世界性公共卫生问 题。我国现广泛使用的是称为大流行流感疫苗的含H5N1型禽流感病 毒的裂解禽流感疫苗来对禽流感进行预防。含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合 疫苗的研究一直为众学者所关注，并以其方便、高效、低成本为新一 代疫苗研究的热点，与单一疫苗相比，联合疫苗可减少疫苗接种次数， 避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、 运输、储存、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，采用单 一疫苗形式生产，由于各个生产环节环环相扣的冷链运作，费用极高。此外，目前同为流感病毒感染的流感和禽流感联合疫苗还未见任 何报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而 提供一种方便、多效、低成本并能有效预防流感和大流行流感的流感 -大流行流感二价联合疫苗。本专利技术的另一个目的是提供一种能高效且低成本地大量制备流 感 - 大流行流感二价联合疫苗的制备方法。为实现本专利技术的第一个目的，本专利技术的技术方案是，该流感-大 流行流感二价联合疫苗包括有流感免疫抗原和禽流感免疫抗原以及 疫苗佐剂。进一步设置是所述的流感免疫抗原为含有H1N1、 H3N2、 B型的血凝素，其HA含量20-40 " g/ml，大流行流感免疫原HA的含量为30-60 u g/ml。进一步设置是所述的流感免疫抗原为流感全病毒灭活液或流感 病毒裂解液或提取的流感病毒亚单位抗原。进一步设置是其流感免疫抗原生产所用流感病毒株为当年WHO 推荐流感病毒株或相似株。进一步设置是所述的禽流感免疫原为用禽流感病毒株制备的禽 流感病毒裂解液。所述的禽流感病毒株为NIBRG-14。进一步设置是所述的疫苗佐剂为甘油或氢氧化铝。该类佐剂为本 领域技术人员所熟知，易于获得和制备。为实现本专利技术的第二个目的，本专利技术的技术方案包括有以下 步骤，(1) 、制备流感疫苗原液，选用当年WHO推荐甲l、甲3及乙型 病毒株制备流感疫苗原液；(2) 、制备大流行流感病毒裂解疫苗原液，该大流行流感病毒裂解 疫苗原液选用禽流感病毒株NIBRG-14为病毒种；(3) 、将步骤(1)和(2)中制备的两种疫苗抗原原液混合后，用 0.01mol/L、 PH 6.8-7.2的PBS溶液稀释，使H1N1、 H3N2、 B型的血 凝素终浓度为20-40 ix g/ml，禽流感免疫原的HA为30-60 u g/ml。进一步设置是所述的流感疫苗原液为流感全病毒灭活液或流感 病毒裂解液或提取的流感病毒亚单位抗原。联合疫苗的免疫效力比较试验文献表明，交叉血凝抑制试验和交叉单向免疫扩散试验证明各型 血清仅与同型抗原有较高的血抑滴度或有反应，与其他型别抗原反应 弱或无反应。所以在注射了流感和禽流感联合疫苗的动物体内分别检 测禽流感和流感抗体基本无互相影响，结果是可信的。采用未检出禽流感和流感病毒的血抑抗体和中和抗体的清洁级 昆明小鼠，体重10 12g，采用不同稀释度的本专利技术所述联合疫苗、 单独的大流行流感疫苗和流感疫苗经肌肉注射免疫小鼠，联合疫苗中注射剂A组含禽流感病毒血凝素3 ug和流感病毒血凝素2 ug，注射 剂B组含禽流感病毒血凝素6 ug和流感病毒血凝素4 ug，单独的大 流行流感疫苗含禽流感病毒血凝素3ug和6ug，流感疫苗含流感病毒 血凝素2ug和4ug，每组4 5只，14天后加强一针，并分别于初免当 天、加强免疫当天及加强免疫后14天采血分离血清，检测血清中禽 流感中和抗体和流感血凝抑制抗体滴度。血凝抑制抗体滴度采用常规 方法。中和抗体测定采用在鸡胚中测定中和抗体，固定病毒，稀释血 清，等量混合，于37。C中和90min后，每只鸡胚接种100EID50/0.5ml， 计算各剂量接种小鼠的抗体几何平均滴度。表l小鼠免疫后的禽流感血清抗体滴度(l:x)剂 联合疫苗 大流行流感疫苗 流感疫苗抗体量 A组 B组3ug 6ug2ug 4ug1 中和抗体- - - -2 中和抗体 20 40 20 40表2小鼠免疫后的流感病毒血清血凝抗体滴度(l:x)联合疫苗 大流行流感疫苗 流感疫苗抗体A组 B组 3ug6ug2ug 4ugAl 11211869- - 1269 2156中和A3 331 522 - - 378 536抗体B64 98 - - 68 128从表1中可看出，小鼠接种一针联合疫苗和大流感疫苗14天 后，禽流感的中和抗体滴度非常低；进行了第二针接种14天后， 中和抗体滴度都有明显升高，且可看出只经流感免疫的小鼠都不 能检测出明显的禽流感中和抗体滴度。数据显示本专利技术提供的流 感 - 大流行流感二价联合疫苗和单独大流行流感疫苗均能诱发小 鼠产生有效的禽流感抗体。表2中所示的数据表明，小鼠接种了本专利技术提供的流感-大流行 流感二价联合疫苗和单独流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流感－大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：包括有流感免疫抗原和大流行流感免疫抗原以及疫苗佐剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李声友，朱文漓，
申请(专利权)人：成都康华生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]