双加氧酶突变体及其在合成(2S,3R)-3-羟基哌啶酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了双加氧酶突变体及其在合成(2S,3R)

【技术实现步骤摘要】
双加氧酶突变体及其在合成(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸中的应用


[0001]本专利技术涉及双加氧酶突变体及其在合成(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸中的应用，属于酶工程及基因工程


技术介绍

[0002]哌啶酸是一种手性环状非蛋白质氨基酸，是脯氨酸的同系物；它存在于许多天然和合成的生物活性分子中。它的衍生物羟基哌啶酸，在自然界中广泛分布，并在一些抗生素、萜类化合物，生物碱中发现。同时羟基哌啶酸也是一种重要的构建块，用于手性药物的合成以及其他领域。(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸已经被证明与胺偶联形成四唑胺的前体，其对P388白血病细胞具有显著的抗菌活性和强烈的细胞毒性；此外，(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸已经被用作GE81112生物合成途径的构建块，GE81112作为翻译抑制剂抑制转运起始复合物的形成。
[0003](2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸可以通过几种方式合成：外消旋后酶解；非对映选择性方法，通常以天然或非天然氨基酸(丝氨酸及其衍生物、谷氨酸或脯氨酸)、碳水化合物(甘油醛或D
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葡萄糖)或者光学活性α
‑
羟基羧酸/1,2
‑
氨基乙醇/亚砜为前体。然而，在这些合成过程中通常涉及危险和有毒的化学品，这会产生有毒的副产品并导致环境问题。此外，选择性差和能耗高的缺点同样存在。相对而言，酶法合成具有高催化效率、高选择性、低能耗和环境友好性等特点，是一种更可行的替代方法。
[0004]关于酶法生成(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸的报道较少，其中Fe(II)/α
‑
酮戊二酸依赖型双加氧酶作为强大的多用途的生物催化剂使它们成为工业生产的理想候选者。值得注意的是，只有属于该家族的少数酶被鉴定为催化L
‑
哌啶酸转化为(2S,3R)
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羟基哌啶酸，包括Streptomyces sp.strain TH1来源的L
‑
脯氨酸
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羟化酶；Sinorhizobium meliloti来源的L
‑
脯氨酸
‑4‑
羟化酶；Streptomyces sp.L
‑
49973来源的GetF。野生型L
‑
脯氨酸
‑3‑
羟化酶虽然能催化L
‑
哌啶酸特异性生成(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸，但是存在催化效率低的问题。

技术实现思路

[0005]针对上述野生型L
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脯氨酸
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羟化酶催化L
‑
哌啶酸转化为(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸催化效率低的缺陷，本专利技术采用酶工程法为提高L
‑
脯氨酸
‑3‑
羟化酶对非天然底物L
‑
哌啶酸的反应性铺平道路。底物浓度为10mM时，粗酶条件下该野生型L
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脯氨酸
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羟化酶催化L
‑
哌啶酸转化为(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸的摩尔产率为21.40％，因此，采用酶工程手段对本专利技术使用的L
‑
脯氨酸
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羟化酶的催化活性进行改造，这对增加具备高效特异性催化L
‑
哌啶酸转化为(2S,3R)
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羟基哌啶酸能力的酶数量，给酶法生成(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸研究带来新的发现
[0006]本专利技术提供一种对L
‑
哌啶酸催化效率提高的L
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脯氨酸
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羟化酶突变体，所述突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L
‑
脯氨酸
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羟化酶的第97位氨基酸突变得到的，以及通过对一轮蛋白质改造正向突变体R97M的第43位氨基酸进行突变得到
的。
[0007]本专利技术提供了一种L
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脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体，所述L
‑
脯氨酸
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羟化酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脯氨酸3
‑
羟化酶的第97位的精氨酸和第43位的天冬酰胺进行突变得到。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述L
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脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脯氨酸3
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羟化酶的第97位的精氨酸突变为甲硫氨酸，同时将第43位的天冬酰胺突变为苏氨酸得到的；命名为R97M/N43T。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述L
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脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脯氨酸3
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羟化酶的第97位的精氨酸突变为甲硫氨酸，同时将第43位的天冬酰胺突变为丙氨酸得到的；命名为R97M/N43A。
[0010]本专利技术还提供了编码上述L
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脯氨酸
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羟化酶突变体的基因。
[0011]本专利技术还提供了一种携带权利要求3所述基因的重组载体。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体包括但不限于：pET
‑
28a。
[0013]本专利技术还提供了一种表达上述L
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脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体或携带上述基因或携带上述重组载体的微生物细胞。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞是以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌为宿主细胞。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞是以细菌或真菌为宿主细胞。
[0016]本专利技术还提供了一种(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸的制备方法，所述方法为，将所述L
‑
脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体或所述微生物细胞添加至含有L
‑
哌啶酸的反应体系中进行反应，制备得到(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为，将L
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脯氨酸
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羟化酶突变体或所述微生物细胞，添加至含有L
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哌啶酸、α
‑
酮戊二酸、L
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抗坏血酸、FeSO4·
7H2O的反应体系中进行反应制备(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，将粗酶(100μL)加入反应体系(150μL)中，终反应体系含有10mM底物L
‑
哌啶酸；α<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
‑
脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体，其特征在于，所述L
‑
脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脯氨酸3
‑
羟化酶的第97位的精氨酸和第43位的天冬酰胺进行突变得到。2.根据权利要求1所述的L
‑
脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体，其特征在于，所述L
‑
脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脯氨酸3
‑
羟化酶的第97位的精氨酸突变为甲硫氨酸，同时将第43位的天冬酰胺突变为苏氨酸得到的；或所述L
‑
脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脯氨酸3
‑
羟化酶的第97位的精氨酸突变为甲硫氨酸，同时将第43位的天冬酰胺突变为丙氨酸得到的。3.编码权利要求1或2所述L
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脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的重组载体。5.表达权利要求1或2所述的L
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脯氨酸
‑3‑
羟化酶突变体或携带权利要求3所述基因或携带权利要求4所述的重组载体的微生物细胞。6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞是以细菌或真菌为宿主细胞。7.一种(2S,3R)
‑3‑
羟基哌啶酸的制备方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂尧，徐岩，管姣姣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：