一种多肉植物的遗传转化方法技术

本发明专利技术提供了一种利用无组织培养的方式对多肉植物进行遗传转化的方法，所述方法包括使用携带目的基因的农杆菌侵染多肉植物外植体叶片，产生携带目的基因的不定芽，同时，通过对侵染体系的优化提高了遗传转化的效率。对侵染体系的优化提高了遗传转化的效率。对侵染体系的优化提高了遗传转化的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种多肉植物的遗传转化方法


[0001]本专利技术涉及植物遗传转化、生物技术、植物基因工程领域，具体地，涉及一种利用非组织培养的方式对多肉植物进行遗传转化的方法。

技术介绍

[0002]虎皮兰(Sansevieria trifasciata)是百合科虎尾兰属植物,原产于非洲西部，作为观赏植物和室内盆栽植物普遍种植，其栽培品种较多，可供较长时间欣赏。虎皮兰被称为空气净化器，可以吸收有害气体，如甲醛、二甲苯和总挥发性有机化合物，被人们称为"天然的清道夫"。虎皮兰还具有药用价值，它能清热解毒、活血消肿，主治感冒、肺热咳嗽、疮疡肿毒、跌打损伤、毒蛇咬伤、烫火伤等。除此之外，有研究报道虎皮兰可以作为重金属污染土壤的植物修复剂，积累多种重金属，目前虎皮兰基因组尚未被破译，关于虎尾兰遗传转化体系的研究也尚未见报道，虎皮兰的转化技术仍处于起步阶段，其改良方案只能依赖于传统的育种方法，限制了对虎皮兰的育种进程。
[0003]在传统的组织培养中，DNA被传递到细胞中，植物通过暴露于各种激素而再生。组织培养只能在少数物种和部分品种中有效，需要大量时间，转化效率低，而且常常会导致不可预测的基因组变化。因此，组织培养是多肉植物中创造转基因和基因编辑植物的最大瓶颈之一。
[0004]因此，本领域迫切需要开发一种适用范围广、操作简单、能够提高多肉植物遗传转化效率的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服组织培养对多肉植物遗传转化的限制，提供了一种无需组织培养对多肉植物遗传转化的方法，在多肉植物无性繁殖特点的基础上，通过递送系统的优化，侵染条件、农杆菌菌株类型和发育调节因子等多个影响因素进行梯度试验，建立了多肉植物组无组培遗传转化体系，提高其遗传转化效率，并从分子水平检测转基因幼芽，为实现更多多肉植物的遗传转化体系奠定基础。
[0006]本专利技术的目的在于提供一种提高多肉植物遗传转化效率的方法。
[0007]本专利技术一方面提供了一种无组织培养对多肉进行遗传转化的方法，包括步骤：
[0008](i)提供待转化的多肉植物和携带目的基因的农杆菌；
[0009](ii)获得的多肉植物叶片作为外植体；
[0010](iii)利用携带目的基因的农杆菌侵染所述外植体；所述侵染包括将外植体与携带目的基因的农杆菌接触；
[0011](iv)将步骤(iii)获得的受侵染的外植体培养生芽，筛选获得携带目的基因的阳性芽，将阳性芽培养得到经过遗传转化的多肉植物。
[0012]在一个实施方式中，所述农杆菌为发根农杆菌或根癌农杆菌。
[0013]在一个实施方式中，所述农杆菌株为发根农杆菌K599。
[0014]在一个实施方式中，所述农杆菌为根癌农杆菌EHA105、GV3101、AGL1或其组合。
[0015]在一个实施方式中，所述步骤(iii)中的所述接触为在常压下将外植体置于农杆菌菌液中浸泡；浸泡时间为5min
‑
30min，例如，10min，15min，20min，25min。
[0016]在一个实施方式中，所述步骤(iii)中的所述接触为将外植体置于农杆菌菌液中浸泡2s
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20s，在浸泡过程中，同时进行真空处理；所述浸泡时间优选为2s
‑
10s，优选地，为2s
‑
5s，更优选地，为2s，5s，10s，20s，进一步优选地，为5s。
[0017]在一个实施方式中，所述步骤(ii)之前，还包括步骤(i
’
)：对所述叶片进行前置处理。
[0018]在一个优选地实施方式中，所述前置处理为人工对叶片进行消毒切割，所述消毒为将多肉植物用75％乙醇冲洗25
‑
35秒，再用2％次氯酸溶液浸泡4
‑
10分钟，无菌水冲洗4
‑
6次；所述切割，将多肉植物的叶片横向切割成长度为5
‑
7厘米的小段。
[0019]在一个实施方式中，所述侵染包括农杆菌菌液侵染和固体培养基农杆菌菌层侵染。
[0020]在一个实施方式中，所述步骤(iii)中浸染包括以下步骤：
[0021](a)将外植体与携带目的基因的农杆菌接触，所述接触为将外植体近基部切口处置于农杆菌菌液中进行浸泡2s
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20s，在浸泡过程中，同时进行真空处理；
[0022](b)将步骤(a)中获得的浸泡后的外植体与固体培养基菌层接触，所述菌层为携带目的基因的农杆菌菌层；
[0023](c)经步骤(b)中获得外植体插入到培养盒(例如，无菌蛭石培养盒)中，用携带目的基因的农杆菌菌液从上到下流向伤口。
[0024]在一个实施方式中，所述真空处理为在给定的空间内低于一个大气压力的气体状态，在一个优选地实施方式中所述真空压强为0.03MPa
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0.09MPa，优选地，为0.03MPa
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0.08MPa，优选地，为0.04MPa
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0.08MPa，优选地，为0.05
‑
0.07MPa，进一步优选地，为0.07MPa。
[0025]在一个优选地实施方式中，所述浸泡的时间为2s
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20s，优选地，为2s
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10s，优选地，为2s
‑
5s，更优选地，为2s，5s，10s，20s，进一步优选地，为5s。
[0026]上述“在浸泡的过程中，同时进行真空处理”，也可以理解为在真空条件下进行浸泡。
[0027]在一个实施方式中，所述固体培养基为TY或YEP固体培养基。
[0028]在一个实施方式中，所述侵染的农杆菌菌液OD600为0.6
‑
1。
[0029]在一个实施方式中，所述步骤(iv)中外植体培养为将外植体插入含有扦插基质的培养盒中，在一种实施方式中，所述基质包括适于植物栽培的固体基质或液体基质，优选的，所述基质包括蛭石、草炭、珍珠岩、岩棉、沙、聚氨酯、泥炭、稻壳炭、树皮等常见的固体基质，更优选的所述基质包括蛭石。在其他的实施方式中，所述固体基质还可以为土壤。优选地，本专利技术所述扦插基质为蛭石和营养土，优选地，蛭石和营养土比例为1：1。
[0030]在一个实施方式中，所述步骤(iv)中还包括对受侵染的外植体在24℃下培养，光照培养的时间16小时/天，暗培养的时间为18小时/天，培养时间3
‑
4月。
[0031]在本专利技术方法中应用了通用的农杆菌液体和固体培养基，适用于大规模转化种类更广的多肉植物。
[0032]在一个实施方式中，所述方法可以实现将目的基因插入到所述多肉植物的基因组上。
[0033]本专利技术中，所述多肉植物选自百合科虎尾兰属、景天科伽蓝菜属或景天科青锁龙属的多肉植物，优选的，所述多肉植物为虎皮兰。
[0034]在一个实施方式中，所述目的基因通过载体导入到农杆菌中，优选地，所述载体选自：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用无组织培养的方式对多肉植物进行遗传转化的方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供待遗传转化的多肉植物和携带目的基因的农杆菌；(ii)获得的多肉植物叶片作为外植体；(iii)利用携带目的基因的农杆菌侵染所述外植体，所述侵染包括将外植体与携带目的基因的农杆菌接触；(iv)将步骤(iii)获得的受侵染的外植体培养生芽，筛选获得携带目的基因的阳性芽，将阳性芽培养得到经过遗传转化的多肉植物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为发根农杆菌或根癌农杆菌；优选地，所述发根农杆菌为K599，所述根癌农杆菌为EHA105、GV3101、AGL1或其组合。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)中，所述接触为将外植体置于农杆菌菌液中浸泡2s
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20s，在浸泡过程中，同时进行真空处理。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)之前，还包括步骤(i
’
)：对所述叶片进行前置处理；优选的，所述前置处理为人工对...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：