LZTR1联合KRAS在制备治疗逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药药物中的应用及其验证方法技术

本发明专利技术公开了LZTR1联合KRAS在制备治疗逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药药物中的应用，属于生物医学和分子生物学领域，本发明专利技术首次公开了可用于检测HCC相关的蛋白质LZTR1及其联合下游蛋白质KRAS在制备HCC诊断、预后标志物和耐药检测相关试剂盒中的应用。本发明专利技术创新性发现在肝癌细胞中LZTR1通过降解下游KRAS蛋白，抑制肝癌发展并参与拮抗仑伐替尼耐药的相关机制。同时预示LZTR1在HCC中具有成为新型生物标志物及有效治疗靶点的潜力。志物及有效治疗靶点的潜力。志物及有效治疗靶点的潜力。

【技术实现步骤摘要】
LZTR1联合KRAS在制备治疗逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药药物中的应用及其验证方法


[0001]本专利技术涉及生物医学和分子生物学领域，具体而言，涉及LZTR1诱导下游KRAS蛋白降解，联合KRAS蛋白在制备治疗逆转肝癌对仑伐替尼耐药药物中的应用。

技术介绍

[0002]原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)是全球第六大最常见的癌症，也是2020年全球第三大癌症死亡原因。其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,约占75％
‑
85％，它是一种预后较差的侵袭性肿瘤，预计其发病率未来还会持续增加。HCC最常见的病因是乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，占发展中国家HCC病例的90％以上，其他危险因素包括黄曲霉毒素、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝、自身免疫性肝炎、肥胖和糖尿病等等。
[0003]截至目前，HCC的治疗一直以手术切除为主，辅以放化疗、介入、射频消融等。然而，由于肝癌发病隐匿，无典型临床特征，早期诊断困难，首次被诊断时大多已是中晚期，手术切除率不足30％。针对这类患者，治疗选择有限，通常以广谱常规细胞毒性药物化疗为主，然而HCC对常规化疗往往存在高度耐药性，患者5年生存率不足15％。近年来随着靶向药物索拉非尼、仑伐替尼；免疫相关药物纳武利尤单抗、帕博利珠单抗等药物的问世，一定程度上打破了中晚期患者治疗的局限性，给HCC的治疗带来了新的曙光。然而其精准治疗过程中仍存在许多问题。
[0004]仑伐替尼是一种口服多靶点受体酪氨酸激酶(RTKs)抑制剂，它的作用是阻断一种可发出癌细胞繁殖信号的异常蛋白质，从而阻止癌细胞的扩散。但近年来的研究发现，人体癌细胞对仑伐替尼极易产生耐药性，仑伐替尼的主要适应症有分化型甲状腺癌、肾癌、肝细胞癌三种癌症，对于不同癌症，仑伐替尼产生耐药的时间也不一样，针对肝细胞癌，单药仑伐替尼治疗肝癌全球无进展生存期仅为7.4个月，总生存期仅13.6个月。
[0005]综上所述，研究开发一种逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药的药物，将为肿瘤靶向治疗药物研发提供思路和解决方法，同时具有巨大的社会效益和经济效益。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的问题是针对肝癌治疗药物仑伐替尼在治疗过程中易产生耐药性进而导致治疗失败甚至疾病复发的问题，提供一种逆转肝癌细胞仑伐替尼耐药性的方法。
[0007]为解决上述问题，本专利技术第一方面提供LZTR1表达增强剂逆转肝癌细胞对仑伐替尼的耐药性。
[0008]亮氨酸拉链样转录调节因子1(LZTR1)起初被认为是一种转录调节因子，与Noonan综合征(NS)，慢性髓系白血病(CML)和神经鞘瘤病的发生密切相关，然而其中的具体机制并不是很清楚。近年来，研究发现LZTR1作为E3泛素连接酶复合物的一部分，介导泛素分子偶
联到RAS蛋白上，从而诱导RAS蛋白的泛素化降解，抑制相关通路激活和下游信号转导。因此，LZTR1发生的致病性突变影响对RAS蛋白的调节，这也解释了其在人类神经系统相关疾病中的作用。此外，LZTR1介导的RAS调节同样可能影响肿瘤发生发展，与肿瘤预后相关。本专利技术利用免疫组织化学染色技术探究LZTR1在HCC中的表达水平，探讨LZTR1作为肝癌标志物的可能性，同时利用克隆形成、划痕实验以及CCK8细胞增殖实验探寻LZTR1对其增殖迁移的影响，此外本专利技术还发现其可通过诱导下游KRAS蛋白降解抑制肿瘤发展，拮抗仑伐替尼耐药。
[0009]进一步地，所述LZTR1表达增强剂为提高肝癌细胞中LZTR1表达水平的分子或制剂。
[0010]优选地，所述提高肝癌细胞中LZTR1表达水平的分子或制剂包括过表达质粒，所述过表达质粒为pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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CopGFP
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T2A
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Puro为载体的LZTR1过表达质粒。
[0011]进一步地，所述述LZTR1过表达质粒所插入的序列如SEQ ID No.1所示。
[0012]本专利技术第二方面提供一种验证LZTR1过表达质粒逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药的方法，包括以下步骤：
[0013](1)：采用生物信息学和免疫组化分析肝癌标本及癌旁组织中LZTR1的表达，并分析LZTR1及预后关系；
[0014](2)：制备LZTR1过表达质粒和CRISPR
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cas9
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LZTR1敲除质粒，并将LZTR1过表达质粒通过质粒转染技术导入肝癌细胞中，实现LZTR1在肝癌细胞中的过表达；
[0015](3)：通过实时荧光定量PCR、Western Blot、克隆形成、划痕实验、CCK
‑
8实验验证LZTR1过表达细胞；
[0016](4)：检测LZTR1下游蛋白丰度；
[0017](5)：制备仑伐替尼耐药肝癌细胞。
[0018]优选地，所述肝癌细胞为HepG2和SK
‑
Hep1肝癌细胞。
[0019]优选地，所述CRISPR
‑
cas9
‑
LZTR1敲除质粒所选择的靶位点如SEQ ID No.2所示，具体为：
[0020]5’‑
AGTCTTTCACATCGAACCGC
‑3’
。
[0021]优选地，所述CRISPR
‑
cas9
‑
LZTR1敲除质粒的载体为pCDH
‑
CMV
‑
MC S
‑
EF1
‑
CopGFP
‑
T2A
‑
Puro。
[0022]进一步地，所述实时荧光定量PCR中使用的引物序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.8所示，具体为：
[0023]LZTR1 F：5
’‑
GCGGGGAGATGTACAAGGTT
‑3’
；
[0024]LZTR1 R：5
’‑
CCCGTAGTCCTCGTGCAG
‑3’
；
[0025]KARS F：5
’‑
AGTCATGGTCACTCTCCCCA
‑3’
；
[0026]KARS R：5
’‑
GCAGTCTGACACAGGGAGAC
‑3’
；
[0027]GAPDH F：5
’‑
CCCTCAGATGCCTGCTTC
‑3’
；
[0028]GAPDH R：5
’‑
CATGCCTTCCGTGTTCC
‑3’
。
[0029]本专利技术具备的有益效果：本专利技术首次公开了可用于检测HCC相关的蛋白质LZTR1及其联本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.LZTR1联合KRAS在制备治疗逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药药物中的应用，其特征在于，通过LZTR1表达增强剂逆转肝癌细胞对仑伐替尼的耐药性。2.如权利要求1所述的LZTR1联合KRAS在制备治疗逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药药物中的应用，其特征在于，所述LZTR1表达增强剂为提高肝癌细胞中LZTR1表达水平的分子或制剂。3.如权利要求2所述的LZTR1联合KRAS在制备治疗逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药药物中的应用，其特征在于，所述提高肝癌细胞中LZTR1表达水平的分子或制剂包括过表达质粒，所述过表达质粒为pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
CopGFP
‑
T2A
‑
Puro为载体的LZTR1过表达质粒。4.如权利要求3所述的LZTR1联合KRAS在制备治疗逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药药物中的应用，其特征在于，所述LZTR1过表达质粒所插入的序列如SEQ ID No.1所示。5.一种验证LZTR1过表达质粒逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）：采用生物信息学和免疫组化分析肝癌标本及癌旁组织中LZTR1的表达，并分析LZTR1及预后关系；（2）：制备LZTR1过表达质粒和CRISPR
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cas9
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LZTR1敲除质粒，并将LZTR1过表达质粒通过质粒转染技术导入肝癌细胞中，实现LZTR1在肝癌细胞中的过表达；（3）：通过实时荧光定量PCR、Western Blot、克隆形成、划痕实验、CCK
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8实验验证LZTR1过表达细胞；（4）：检测LZTR1下游蛋白丰度；（5）：制备仑伐替尼耐药肝癌细胞。6.如权利要求5所述的验证LZTR1过表达质粒逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药的方法，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2和SK
‑
Hep1肝癌...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶钢辉，金晓锋，叶孟，朱辰璐，夏婧怡，顾超宇，李新铭，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：