【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在细胞培养期间降低分泌的重组表达蛋白质中半胱氨酸残基的氧化水平的方法
[0001]本披露涉及用于在细胞培养期间，例如在哺乳动物细胞重组产生抗IL
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17抗体如苏金单抗(secukinumab)期间，降低分泌的重组表达蛋白质中一个或多个半胱氨酸残基的氧化水平的方法。
技术介绍
[0002]经典抗体由两条轻链(L)和两条重链(H)组成，两条轻链的分子量各自为约25kD，两条重链的分子量各自为约50kD。轻链和重链通过二硫键(L
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S
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S
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H)连接，并且两个LH单元通过两个二硫键进一步连接在重链之间。经典抗体的通式为L
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SS
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H(
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SS
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)2H
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SS
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L或简化为H2L2(HHLL)。除了这些保守的链间二硫键之外，还有保守的链内二硫键。两种类型的二硫键对于抗体的稳定性和行为(例如，亲和力)都很重要。通常，二硫键由在抗体链中的保守位置发现的两个半胱氨酸残基(Cys
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SH)产生，这两个半胱氨酸残基自发形成二硫键(Cys
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S
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S
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Cys)。二硫键的形成由环境的氧化还原电势和硫醇
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二硫化物交换中专用的酶的存在决定。内部二硫键(Cys
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S
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S
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Cys)使抗体的三维结构稳定。>[0003]存在含有额外的一个或多个游离半胱氨酸(即，未配对的半胱氨酸)的抗体。在一些情况下，一个或多个游离半胱氨酸参与抗原识别和结合，例如因为在抗体的互补决定区中存在游离半胱氨酸。对于这些抗体，游离半胱氨酸的修饰可能对分子的活性和稳定性具有负面影响，并且可导致增加的免疫原性。因此，对这些抗体的加工可能是困难的，因为最终产物可能含有大量无活性的、错误折叠的和/或无用的抗体材料。通过援引整体并入本文的US 20090280131提供了抗IL
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17抗体，例如苏金单抗(即，AIN457)，其在轻链互补决定区(CDR)3环(L
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CDR3)中的顺式脯氨酸之后具有游离半胱氨酸残基(即，如SEQ ID NO:6所示的L
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CDR3的第八位氨基酸，该氨基酸对应于如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区的氨基酸97，下文称为“CysL97”)。为了保持完全活性，苏金单抗的未配对半胱氨酸残基不能通过与其他半胱氨酸残基的氧化二硫化物配对或通过用外源化合物氧化(例如，与其他蛋白质形成混合二硫化物，用细胞代谢物(例如，半胱氨酸或谷胱甘肽)衍生化，和通过氧形成亚砜)进行掩蔽。不幸的是，因为苏金单抗是使用哺乳动物细胞制造的，这些哺乳动物细胞将苏金单抗分泌到细胞培养基中，所以确实发生了不期望的基于细胞的CysL97修饰。
[0004]类似地，将游离半胱氨酸工程改造到抗体序列中可用于促进化学接头、药物、标记和/或其他部分的定点缀合。例如，Junutula等人(Nat.Biotechnol.[自然生物技术],2008,26,925
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932)通过重链丙氨酸114的突变将工程化半胱氨酸引入抗MUC16抗体中。作者发现突变的抗体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达生成具有工程化半胱氨酸残基的抗体，该半胱氨酸残基用半胱氨酸或谷胱甘肽作为二硫化物封端。因此，必须对工程化半胱氨酸残基进行处理以去除不期望的基于细胞的修饰。
[0005]已经报道了选择性还原其游离半胱氨酸残基被氧化的抗体的方法。例如，WO 2016/103146 A1中披露了在哺乳动物细胞已经重组产生的IL
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17抗体的制剂中的氧化
CysL97的还原。具体地，应用下游加工步骤，诸如使包含抗体的制剂与至少一种还原剂在系统中接触以形成还原混合物；以及温育该还原混合物，同时保持该系统中的氧体积传质系数(kLa*)<约0.37h
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1，所述kLa*通过将溶解氧曲线改编为饱和曲线来计算。类似地，Junutula等人报道了采用强还原剂(例如，三(2
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羧乙基)膦[TCEP]或二硫苏糖醇[DTT])，纯化还原的抗体和随后使用Cu
2+
或脱氢抗坏血酸再氧化链间二硫键的程序。
[0006]然而，此类下游方法步骤可能需要昂贵的设备、额外的纯化步骤，并导致延长的工艺提前期(process lead time)。因此，需要允许更快和/或成本更低的总体制造的改进方法。因而，也可以评价重组抗体生产的上游加工步骤中的方法进行优化。
[0007]用于工业应用(诸如表达重组多肽)的分泌性哺乳动物细胞的培养需要支持生长和生产的培养基。此类培养基必须支持高的活细胞密度，同时还刺激生物产物的合成和细胞外转运。早期的培养基开发努力得到了维持生长、活力和细胞功能的基本配制品，但这些基本配制品包含动物来源的组分和用于分批培养模式的复杂组成部分。随后的改进包括无血清和化学限定(CD)培养基的开发，关键营养物、生长因子和潜在抑制性或毒性细胞代谢物的鉴定，以及使用补料分批培养技术和灌注培养技术优化营养物递送同时最小化不需要的废弃产物的累积。
[0008]所有细胞培养基都需要类似的基本营养物以支持细胞生长。氨基酸是细胞培养基中的关键组分，并且研究已经证实细胞培养基的氨基酸组成的微小变化可改变生长曲线和滴度。例如，Ghaffari等人(Biotechnol Progress[生物技术进展].2020；36:e2946)报道称维持所称的非必需氨基酸即半胱氨酸的可用性是普通CHO细胞系中高产率重组蛋白生产的关键工艺参数。然而，半胱氨酸在典型细胞培养基的pH及氧和金属富集条件下容易被氧化。然而，半胱氨酸也可以促进重组蛋白的游离半胱氨酸残基不期望的氧化。因此，半胱氨酸补料策略通常需要高度优化以便从CHO细胞获得高产率的重组表达蛋白。
[0009]许多细胞培养基和培养基补料是可商购获得的以提供关键营养物。然而，为了在生产中优化具有还原的半胱氨酸残基的分泌性重组多肽的质量和产率，仍然需要定制针对重组多肽的培养基和补料。由于细胞培养条件中有许多参数可以改变，工艺优化是复杂的，即使对于可商购获得的重组多肽诸如抗体而言，仍然需要提供用于工业生产的优化工艺。
技术实现思路
[0010]尽管在细胞培养基领域进行了广泛的研究和优化，但是令人惊讶地发现，减少哺乳动物细胞培养基中添加的半胱氨酸的量以降低培养基中cys等同物的浓度可以减少对所表达的抗体的游离半胱氨酸的不期望的修饰。这种减少量的不期望的游离半胱氨酸修饰可导致抗体活性提高和/或避免对随后抗体还原和任选再氧化的需要。
[0011]根据第一方面，本披露提供了一种用于在补料分批细胞培养物中产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
[0012]a.在包含基础培养基和一种或多种补料培养基的细胞培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在补料分批细胞培养物中产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a.在包含基础培养基和一种或多种补料培养基的细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中所述基础培养基包含浓度为约0.3g/L的cys等同物，并且其中所述补料培养基包含浓度小于约0.8g/L的cys等同物，并且其中所述细胞培养基中累积cys等同物的浓度小于约0.4g/L；b.表达所述重组多肽以及c.从所述培养基中回收所述多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且所述补料培养基包含浓度为约0.66g/L的半胱氨酸。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且所述进料培养基包含浓度为约0.33g/L的半胱氨酸。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且所述补料培养基不包含半胱氨酸。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组多肽是抗体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体是苏金单抗。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由CHO细胞、HEK细胞和SP2/0细胞组成的组。8.根据权利要求5
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7中任一项所述的方法，所述方法包括选择性还原的下游加工步骤，其中所述抗体与至少一种还原剂在系统中温育以形成还原混合物。9.根据权利要求5
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8中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：d.纯化所述抗体；e.配制所述抗体用于施用f.将所述抗体与小册子一起包装。10.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述重组多肽包含至少一个游离半胱氨酸。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组多肽包含至少一个二硫键和至少一个游离半胱氨酸。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组多肽是抗体，诸如苏金单抗。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述培养基回收的重组多肽群体与从对照培养基回收的重组多肽群体相比包含高至少约10％水平的还原的游离半胱氨酸，所述对照培养基包含具有浓度大于约0.4g/L的cys等同物的对照基础培养基和/或含有浓度大于约0.9g/L的cys等同物的对照补料培养基，和/或其中所述对照细胞培养物中累积cys等同物的浓度大于约0.4g/L。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括与对照方法相比以mg重组多肽/L培养基计，产生更高产率的重组多肽，所述对照方法包括在对照细胞培养基中培养哺乳动物细胞，所述对照细胞培养基包含对照基础培养基和一种或多种对照补料培养...
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