转基因玉米事件p2DBEN-CP-BZ-6及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种核酸序列，其包含选自序列SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
转基因玉米事件p2DBEN
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CP
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BZ
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6及其检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物及其产品的检测方法，利用玉米合成虾青素且耐受草铵膦除草剂施用的转基因玉米事件p2DBEN
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CP
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BZ
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6和用于检测转基因玉米p2DBEN
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CP
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BZ
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6的核酸序列及方法，具体涉及虾青素的功能验证的核酸序列及方法。

技术介绍

[0002]植物生长只需要阳光、水和土壤等温室条件。温室的构建比细菌、哺乳动物和昆虫细胞等培养系统所需的生物反应器组便宜。此外，各种有益植物营养素的产量可以根据种植的植物数量按比例增加或减少。与传统生产系统不同，人畜共患病原体不能感染植物，因此不会成为分子农业衍生产品的污染源。食用疫苗也在开发中，这种方法的安全性和可行性在概念验证1期临床试验中得到证明，表明新的可食用植物疫苗现在可以产生有意义的免疫反应。然而，在临床接受这些候选疫苗之前需要进一步优化。确保可食用植物疫苗不会导致对用于生产的植物过敏至关重要，尤其是大米、谷物和玉米等广泛消费的植物。从那以后，植物中产生的重组蛋白产量大幅增加，这表明新的可食用植物疫苗现在可以产生有意义的免疫反应。祝钦泷、刘耀光等在《Trends in Biotechnology》发表的题为“Molecular farming using transgenic rice endosperm”的文章系统总结了水稻胚乳作为生物反应器的优缺点、拓展了分子农场的概念。水稻胚乳是淀粉的主要合成场所，是大米的主要食用部分。因其遗传与生物信息资源丰富、具有表达外源蛋白和代谢物的能力、提取和处理目标产物的简易性、较低的生产成本和较高的生物安全性等优点，被广泛用于分子农业生产重组医用蛋白多肽和生物活性物质。玉米(Zea mays L. )在世界上很多地区都是主要的粮食作物。生物技术已经应用于玉米以改善其农艺性状和品质。如何提高目标产物含量，利用水稻胚乳、玉米胚乳活性物质代表着植物分子农场的未来发展方向。
[0003]作为酮式类胡萝卜素，虾青素的合成在细菌、真菌、藻类和少数植物中均有完整的合成代谢途径。类胡萝卜素的合成代谢途径在各物种中大同小异，以开花植物为例 (Hirschberg, 2001)，以3
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磷酸甘油醛（GA3P）和丙酮酸为起始底物经过多步反应生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）。而后两分子的GGPP在八氢番茄红素合成酶（PSY）的作用下形成八氢番茄红素，这是类胡萝卜素合成的限速节点。在经氧化形成番茄红素后进行分支，一条路径在LCY
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e的作用下向合成叶黄素（lutein）方向进行，另一条则向β
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胡萝卜素（β
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carotene）方向进行，最后形成脱落酸ABA。但一些中间产物的积累比如β
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胡萝卜素和玉米黄质（zeaxanthin）会使对应的组织器官呈现黄到橘红色的各种过渡色。而β
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胡萝卜素作为维生素A的前体物质被广泛的用于商业开发。
[0004]虾青素作为添加剂在食品、饲料、保健品、医药品和化妆品中具有较高的附加值，因此关于虾青素的基因工程研究率先在藻类和微生物中进行。由于这些受体生物缺乏存储虾青素的机制，所以以藻类和微生物为生物反应器生产虾青素的产量普遍不高。因此，以植物为生物反应器的虾青素基因工程应运而生。首先在模式植物烟草中进行了尝试，导入
PaCrtI的烟草在花中首次合成了虾青素 (Mann et al., 2000)，采用同样的基因但选用组成型启动子的转基因烟草叶片中合成的虾青素为165 μg/g干重 (Zhu et al., 2007)。而同时融合表达海洋细菌（Paracoccus）CrtW和CrtZ的转基因烟草和番茄中积累的虾青素量虽有提升但仍然很少 (Ralley et al., 2004)，另外一个海洋细菌（Brevundimonas sp., strain SD212）的CrtW和CrtZ通过叶绿体转化获得转基因烟草叶片中虾青素的含量高达5.44 mg/g干重 (Hasunuma et al., 2008)。将雨生红球藻的酮化酶基因BKT转入土豆和胡萝卜后，虾青素的积累量分别达14μg/g干重 (Morris et al., 2006) 和91.6μg/g鲜重 (Jayaraj et al., 2008)。北京大学陈锋教授课题向拟南芥和烟草分别转入三种和物种藻类来源的酮化酶基因BKT后，比较分析均发现来自莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的CrBKT使转基因作物积累虾青素量最高分别达到2.07 mg/g干重 (Zhong et al., 2011)和1.60 mg/g干重 (Huang et al., 2012)，该研究组进一步同时在番茄中表达CrBKT和来自雨生红球藻的羟化酶基因HpBHY后，转基因番茄果实中虾青素积累达到16.1 mg/g干重 (Huang et al., 2013)。玉米中仅有一例关于虾青素基因工程的研究工作，该研究通过基因枪共转化的方式获得同时表达CrBKT和BrCrtZ（Brevundimonas sp., strain SD212）的转基因玉米籽粒积累16.77 μg/g干重的虾青素 (Farr
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et al., 2016)，但其存在转化方式带来的外源基因碎片化和基因分离的问题以及缺少对种质中的虾青素特性的评价，而我国在玉米中没有类似的研究服务于我国的虾青素市场需求。番茄红素是虾青素生物合成前体供应链中的重要节点，虾青素产生过程中存在多种酶催化β
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胡萝卜素或玉米黄素转化为虾青素的生物合成途径。由于玉米中缺乏番茄红素，所以相对于番茄和藻类，生成虾青素含量较低，但创制富含虾青素的玉米，很大程度提高了营养强化产品的有效性和延展性，创制的营养强化产品具有广阔应用前景。
[0005]除了功能基因本身，调控元件的选择及其顺序排布对于获得良好的转化事件是至关重要的，并且其技术效果是难以预料的。另外已知外源基因在植物体内的表达受其插入玉米染色体组位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。
[0006]能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸序列，其特征在于，包含选自序列SEQ ID NO:1
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7或其互补序列中的一种或多种，所述核酸序列来源于转基因玉米事件p2DBEN
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CP
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BZ
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6，包含所述转基因玉米事件p2DBEN
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CP
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BZ
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6的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202330保藏于中国典型培养物保藏中心。2.一种DNA引物对，包含第一引物和第二引物，其特征在于，所述第一引物和所述第二引物各自包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，且当与含有玉米事件p2DBEN
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CP
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BZ
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6的DNA一起用于扩增反应时，产生检测样品中玉米事件p2DBEN
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CP
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BZ
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6的扩增子；包含所述事件的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202330保藏。3.根据权利要求2所述的DNA引物对，其特征在于，所述第一引物选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12；所述第二引物选自SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO:14。4.根据权利要求2所述的DNA引物对，其特征在于，所述第一引物选自SEQIDNO:1或其互补序列、SEQIDNO:8或SEQ ID NO:12，所述第二引物选自SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13；或者所述第一引物选自SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15，所述第二引物选自SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14。5.一种DNA探针，其特征在于，包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，所述DNA探针在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交，并在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交。6.根据权利要求5所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针包含选自SEQ ID NO:3或其互补序列、SEQ ID NO:4或其互补序列的序列。7.根据权利要求5所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针包含选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列和SEQ ID NO:7或其互补序列的序列。8.一种标记物核酸分子，其特征在于，包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，所述标记物核酸分子在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交，并在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交。9.根据权利要求8所述的标记物核酸分子，其特征在于，所述标记物核酸分子包含选自SEQ ID NO:3或其互补序列、SEQ ID NO:4或其互补序列的序列。10.根据权利要求8所述的标记物核酸分子，其特征在于，所述标记物核酸分子包含选自SEQ ID NO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋喻鑫睿，陈茹梅，曹筠嵩，柳小庆，马旭辉，吕一帆，
申请(专利权)人：捷康生物科技海南有限公司，
类型：发明
国别省市：