转基因大豆事件JK1001-1及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种核酸序列，其包含选自序列SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
转基因大豆事件JK1001
‑
1及其检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及含人乳铁蛋白基因及对耐受草甘膦除草剂施用的转基因大豆事件JK1001
‑
1和用于检测转基因大豆JK1001
‑
1的核酸序列及方法。

技术介绍

[0002]乳铁蛋白是广泛分布于具有分泌功能的组织及其分泌物中的蛋白，最早于1939年在牛奶中发现，并于1960年从牛奶和人乳汁中被分离。在人体中，初乳中含量最高，达8mg/ml，在乳汁中为1.5
‑
4mg/ml，在泪液中为2mg/ml，在其他分泌物（如唾液、关节液、血浆）中含量较低，一般低于0.01mg/ml。其被认为与铁转运和储存相关，属于乳转铁蛋白（Lactotransferrin）家族。乳铁蛋白序列在人、牛、鼠、猪等物种当中高度保守，为约690个氨基酸残基的糖蛋白，分子量约76
‑
81kDa。在三维结构上，乳铁蛋白包含N
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和C
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两个小叶（lobe），每个小叶在两个结构域之间的深裂隙中能够结合一个单独的Fe
3+
离子。
[0003]在消化道中，乳铁蛋白会被水解成为具有生理功能的小肽——乳铁蛋白活性多肽（LFcin B），它是含有25个氨基酸的多肽，具有强碱性（pH>8.15），其水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构，具有耐热、在消化道中不易降解、调节免疫活动、广谱抑菌等特性。这也是口服乳铁蛋白发挥活性的基础。迄今为止，乳铁蛋白的研究开发与应用已成为科学研究的重点，现有研究表明，乳铁蛋白具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、免疫调节、促进骨骼生成、调节肠道菌群等活性，其在疾病预防、辅助治疗等方向上得到广泛应用。
[0004]目前乳铁蛋白的制备主要依赖于从牛奶中提取，例如飞鹤集团应用先进的层析超滤技术,实现了乳铁蛋白的提取，建成了行业内第一条乳铁蛋白自动化生产线。然而从牛奶中提取乳铁蛋白，具有动物病原污染的风险，此外乳铁蛋白的天然含量不足，约14kg牛奶中仅能提取1g蛋白，这都限制了从牛奶中大量制备乳铁蛋白，也使得乳铁蛋白的价格高达7000~8000元/kg。
[0005]为了大量生产乳铁蛋白，目前，已经有在大肠杆菌、毕赤酵母、小鼠、奶牛、马铃薯和大米中表达乳铁蛋白的成功案例，然而通过原核生物表达的蛋白通常因为缺少翻译后修饰而不具有生物活性。以酵母或动物细胞培养来表达这些蛋白不仅成本高而且条件要求高。
[0006]植物果实或种子具有较强的蛋白合成功能，若能以转基因植物来表达乳铁蛋白，其产物接近天然即具有较高的生物活性、表达量高、成本低而且简单易行。但是现有技术中很少有人利用植物尤其是大豆来大量生产乳铁蛋白。
[0007]大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)在世界上很多地区都是重要的粮食作物及油料作物。生物技术已经应用于大豆以改善其农艺性状和品质。在大豆生产中一个重要的农艺性状是除草剂耐受性，特别是耐受草甘膦除草剂。大豆对草甘膦除草剂的耐受性可以通过转基因的方法使草甘膦除草剂耐受型基因(epsps)在大豆植物中表达而获得。
[0008]除了功能基因本身，调控元件的选择及其顺序排布对于获得良好的转化事件是至
NO:2或其互补序列。在一些实施方式中，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列。在一些实施方式中，所述核酸序列包括SEQ ID NO:5或其互补序列。
[0013]所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因大豆事件JK1001
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1中在插入序列的5
’
末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1或其互补序列跨越了大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5
’
末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件JK1001
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1的存在。所述SEQ ID NO:2或其互补序列为转基因大豆事件JK1001
‑
1中在插入序列的3
’
末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的3
’
末端的DNA序列和大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件JK1001
‑
1的存在。
[0014]本专利技术提供的核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少12个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中5
’
侧翼大豆基因组DNA区域的任何部分的至少12个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ IDNO:1的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物对。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1的扩增产物时，可以诊断转基因大豆事件JK1001
‑
1或其后代的存在。本领域技术人员熟知，第一和第二核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本专利技术中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是大约17个到50个或更多的连续核苷酸。所述SEQ ID NO:3或其互补序列为转基因大豆事件JK1001
‑
1中在插入序列的5
’
末端位于插入接合部位附近的一个长度为1170个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列由600个核苷酸的大豆侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1
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600)、383个核苷酸的JK1001
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1构建体RB端序列(SEQ ID NO:3的核苷酸601
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983)组成、187个核苷酸的prGmA1aB1b部分序列（SEQ ID NO:3的核苷酸984
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1170）组成，包含所述SEQ IDNO:3或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件JK1001
‑
1的存在。
[0015]所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸序列，其特征在于，包含选自序列SEQ ID NO:1
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7或其互补序列中的一种或多种，所述核酸序列来源于转基因大豆事件JK1001
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1，所述转基因大豆事件JK1001
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1的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202332保藏在中国典型培养物保藏中心。2.一种DNA引物对，包含第一引物和第二引物，其特征在于，所述第一引物和所述第二引物各自包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，且当与含有大豆事件JK1001
‑
1的DNA一起用于扩增反应时，产生检测样品中大豆事件JK1001
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1的扩增子。3.根据权利要求2所述的DNA引物对，其特征在于，所述第一引物选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12；所述第二引物选自SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO:14。4.根据权利要求2所述的DNA引物对，其特征在于，所述第一引物选自SEQIDNO:1或其互补序列、SEQIDNO:8或SEQ ID NO:12，所述第二引物选自SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13；或者所述第一引物选自SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15，所述第二引物选自SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14。5.一种DNA探针，其特征在于，包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，所述DNA探针在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交，并在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交。6.根据权利要求5所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针包含选自SEQ ID NO:3或其互补序列、SEQ ID NO:4或其互补序列的序列。7.根据权利要求5所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针包含选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列和SEQ ID NO:7或其互补序列的序列。8.一种标记物核酸分子，其特征在于，包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，所述标记物核酸分子在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交，并在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交。9.根据权利要求8所述的标记物核酸分子，其特征在于，所述标记物核酸分子包含选自SEQ ID NO:3或其互补序列、SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕一帆，宋喻鑫睿，曹筠嵩，陈素妃，
申请(专利权)人：捷康生物科技海南有限公司，
类型：发明
国别省市：