西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记及其用途制造技术

本发明专利技术属于蔬菜品质性状分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，适用于西瓜果肉硬度快速筛选和分子标记辅助育种，具体涉及一种新型且简便的分子标记及辅助选择方法。本发明专利技术公开了一种基于西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH，所述KASP分子标记为InDel插入缺失标记，位于西瓜6号染色体的13154621bp处。本发明专利技术还同时公开了用于鉴定西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记ClFH引物组合。本发明专利技术还同时公开了上述分子标记的用途：用于不同果肉硬度的西瓜材料或其后代的分子辅助选择育种。选择育种。选择育种。

【技术实现步骤摘要】
interpretive review of consumer attitudes,and preferences for apples.Postharvest Biology and Technology[J],28:333
‑
347；
[0010]JIANG F L,LOPEZ A,JEON S,et al.2019.Disassembly of the fruit cell wall by the ripening
‑
associated polygalacturonase and expansin influences tomato cracking.Horticulture Research[J],6:17；
[0011]RISSE L A,BRECHT J K,SARGENT S A,et al.1990.STORAGE CHARACTERISTICS OF SMALL WATERMELON CULTIVARS.Journal of the American Society for Horticultural Science[J],115:440
‑
443；
[0012]VILLARREAL N M,ROSLI H G,MARTINEZ G A,et al.2008.Polygalacturonase activity and expression of related genes during ripening of strawberry cultivars with contrasting fruit firmness.Postharvest Biology and Technology[J],47:141
‑
150；

技术实现思路

[0013]本专利技术要解决的技术问题是提供一种西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记及其用途。
[0014]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于BSA混池测序定位西瓜果肉硬度性状基因用于鉴定不同西瓜果肉硬度的KASP分子标记；
[0015]所述KASP分子标记ClFH为InDel插入缺失标记，位于西瓜6号染色体的13154621bp处；分子标记位点前后100bp序列为：
[0016]TCGAAACAAAACTTTTAAGTACGAATATATATATACATTAATTCCTTGCTTTAATAAAC TTATAAATTTCAGATAATGGAAACTATAGATCGAAAAGAAA[AAAAAAAAAAG/
‑
]AAAAA AAAAAGAAAAAAAAAAAGTATTGAAGATCTTTATTTGTAAGAGACAAAGGAAAGATAG ACTAAATGATGGGATGGGAAAGAGGG；
[0017]其中括号内是InDel的片段，突变型表现为InDel的缺失。
[0018]另外，本专利技术还提供了用于鉴定西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记ClFH引物组合，其中的核苷酸序列为5
’‑3’
[0019]正向引物F1：
[0020]GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTC
[0021]正向引物F2：
[0022]GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTT
[0023]反向引物R：
[0024]TCAGATAATGGAAACTATAGATCGA
[0025]本专利技术还同时提供了上述分子标记的用途，用于不同果肉硬度的西瓜材料或其后代的分子辅助选择育种。
[0026]作为本专利技术的分子标记的用途的改进：判定西瓜不同西瓜材料及其杂交后代是属于以下的哪种基因型：纯合HH基因型，纯合hh基因型、杂合Hh基因型。
[0027]本专利技术还同时提供了利用上述分子标记鉴定西瓜果肉硬度的方法，包括以下步骤：
[0028](1)、设定突变类型西瓜材料ZJU152(果肉硬度大)为HH(Hard)基因型；
[0029](2)、提取待测西瓜样本基因组DNA；利用上述ClFH分子标记引物组在ABI Stepone PCR仪上对西瓜基因组DNA进行PCR扩增；利用ABI Stepone PCR仪检测荧光信号，并分析基因分型；根据PCR产物荧光信号的差异，进而鉴别出每个待测西瓜的基因型，鉴定出纯合HH基因型，纯合hh基因型、杂合Hh基因型；
[0030](3)、当样本的分型结果为纯合HH基因型，鉴定该待测西瓜样本为硬肉性状；
[0031]当样本的分型结果为纯合hh基因型，鉴定该待测西瓜样本为软肉性状。
[0032]本专利技术还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：
[0033](1)以硬肉西瓜材料ZJU152和软肉西瓜材料ZJU163为亲本进行杂交，然后自交，从而获得软肉硬肉分离的F6重组自交系群体；
[0034](2)用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代F6群体幼苗基因组DNA；
[0035](3)挑选F6群体中极端果肉硬度材料构建软肉、硬肉混池，采用BSA(分离群体分析，Bulked Segregant analysis)定位与果肉硬度性状相关的区域或基因。
[0036](4)鉴定与西瓜果肉硬度性状紧密连锁的SNP变异和InDel插入缺失变异。
[0037](5)基于连锁的变异，采用KASP(竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，Kompetitive Allele Specific Polymerase Chain Reaction)方法进行西瓜果肉硬度性状分子标记的筛选；
[0038](6)开发出一个与西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH。
[0039]本专利技术的采用上述分子标记鉴定不同西瓜果肉硬度材料的方法为：
[0040](1)分子标记在硬肉材料ZJU152和软肉材料ZJU163及其后代群体中的多态性分析：
[0041]设计开发KASP分子标记，用于检测硬肉软肉亲本材料及其后代的基因型多态性。KASP分子标记引物组合有正向引物F1、F2和反向引物R组成。引物(分子标记)可委托上海生工生物工程股份有限公司合成，在ABI Step One PCR仪上进行扩增。
[0042]PCR反应体系为：20
‑
50ng/μl西瓜基因组DNA5.0μl，KASP Master Mix 5.0μl，KASP Assay Mix(F1：F2：R＝2:2:5的体积比，三种引物浓度均为10ng/μl)0.14μl，总体积为10.14μl；
[0043]PCR反应程序为：30℃，1分钟(读取荧光信号)；94℃，15分钟(预变性)；94℃，20秒(变性)；61℃(
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH，其特征在于：所述KASP分子标记为InDel插入缺失标记，位于西瓜6号染色体的13154621bp处。2.根据权利要求1所述的基于西瓜果肉硬度性状紧密连锁的KASP分子标记ClFH，其特征在于：分子标记位点前后100bp序列为：TCGAAACAAAACTTTTAAGTACGAATATATATATACATTAATTCCTTGCTTTAATAAACTTATAAATTTCAGATAATGGAAACTATAGATCGAAAAGAAAAAAAAAAAAAG/
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AAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAGTATTGAAGATCTTTATTTGTAAGAGACAAAGGAAAGATAGACTAAATGATGGGATGGGAAAGAGGG；其中下划线对应的是InDel的片段，突变型表现为InDel的缺失。3.用于鉴定西瓜果肉硬度性状的KASP分子标记ClFH引物组合，其特征在于：核苷酸序列为5
’‑3’
；正向引物F1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTC正向引物F2:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATACTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTT反向引物R：TCAGATAATGGAAACTATAGATCGA。4.如权利要求1或2所述的分子标记的用途：用于不同果肉硬度的西瓜材料或其后代的分子辅助选择育...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明方，周艺梅，胡仲远，杨景华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：