一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养方法及应用技术

本发明专利技术属于菌种制备技术领域，公开了一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养方法及应用。所述固体培养方法包括以下步骤：配制由红糖、愈创木酚、牛肉浸膏、甘氨酸、MgSO4、KH2PO4、马铃薯粉和琼脂粉组成的固体培养基；分离暗褐脉柄牛肝菌菌种，取子实体菌柄与菌盖交界的中间部位2～3mm的菌肉组织，将该组织放入PDA培养基中，直至菌丝完全覆盖整个培养皿，在菌落外围将菌丝打成菌块；将菌块接种至固体培养基，培养得到暗褐脉柄牛肝菌菌丝体。经本发明专利技术方法培养所得的菌丝浓密、生长势旺盛，边缘整齐，且有同心环。进一步研究表明该暗褐脉柄牛肝菌的菌丝体对烟草花叶病毒具有明显的抑制作用，抑制率达96.33％，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养方法及应用


[0001]本专利技术涉及菌种制备
，特别涉及一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养方法，以及在防治植物病害上的应用。

技术介绍

[0002]暗褐脉柄牛肝菌Phlebopus portentosus(Berk.&Broome)Boedijn又名暗褐网柄牛肝菌、黑牛肝菌，在分类上隶属于牛肝菌目Boletales、小牛肝菌科Boletinellaceae、脉柄牛肝菌属Phlebopus。其最早描述于斯里兰卡，之后在泰国，中国的云南、贵州、广东、海南等亚洲热带、亚热带地区均发现有分布。暗褐脉柄牛肝菌个体肥大、味道鲜美，所以一直备受群众喜爱。研究表明其含有丰富的蛋白质、粗脂肪、总糖、粗纤维以及钾、钙、镁、铁、锌等多种人体所需的矿质元素。并且具有急性肝损伤的保护作用、抗氧化、抗高血糖症(α
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葡萄糖苷酶抑制剂)、抗高血压症、神经细胞保护作用、抗菌、抗癌等活性，是一种极具研究和开发价值的食药用真菌。但是野生的暗褐脉柄牛肝菌菌丝体、子实体，因资源稀少、且受季节条件等限制，不容易获得，大大限制了进一步的应用，而通过人工纯培养，可在短时间内获得大量的菌丝体，因此我们选择对暗褐脉柄牛肝菌进行固体培养。
[0003]烟草花叶病毒Tobacco mosaicvirus(TMV)，又译为烟草花叶病毒，是一种RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损，给国家经济带来巨大损失。在19世纪70年代，人们就发现食用菌深层发酵液和固体培养物水浸液对植物病毒有抑制作用[王晶英等.中国食用菌，1997，16(2)：6
–
7)]。此外，专利文献(CN 113234605A)中报道制备固体和液体培养基培养暗褐脉柄牛肝菌，并未提及对植物病毒的作用。专利文献(CN101341888 A)中仅提及一种牛肝菌提取物及其制备方法和应用，但并未添加对烟草花叶病毒有高效抑制作用的愈创木酚和甘氨酸。而我们知道愈创木酚、甘氨酸、Mg
2+
和K
+
能相互协调促进牛肝菌生长并且有效抗病毒。因此，迫切需要一种添加愈创木酚和甘氨酸的固体培养基培养暗褐脉柄牛肝菌用来防治烟草花叶病毒。

技术实现思路

[0004]针对以上现有技术存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养方法。该方法培养所得的暗褐脉柄牛肝菌菌丝体能有效抑制烟草花叶病毒病害。
[0005]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0006]一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养方法，包括如下制备步骤：
[0007]S1、将200g马铃薯洗净去皮切成小块，加水煮25min，用八层纱布过滤，加热，再加15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，115℃灭菌20min后取出试管摆斜面或者摇匀，将制成的PDA培养基冷却后贮存备用；
[0008]S2、将红糖、愈创木酚、牛肉浸膏、甘氨酸、MgSO4、KH2PO4、马铃薯粉和琼脂粉加入到
水中，煮沸至琼脂粉完全融化，得固体培养基，将培养基分装于三角瓶中，120℃灭菌30min，待冷却凝固后得到固体培养基；
[0009]S3、用解剖刀分离暗褐脉柄牛肝菌菌种，取菌柄与菌盖交界的中间部位2～3mm的菌肉组织，将该组织放入PDA培养基中，直至菌丝完全覆盖整个培养皿，在菌落外围将菌丝打成菌块；
[0010]S4、在无菌环境下，将菌块接种至固体培养基，置于培养箱中培养，得到暗褐脉柄牛肝菌的菌丝体；
[0011]进一步地，步骤S2中所述固体培养基组成为：每升水中加入红糖10～30g，50～60mmol/L愈创木酚0.2～0.4mL，牛肉浸膏1～3g，甘氨酸10～20g，MgSO
4 0.5～1.5g，KH2PO
4 1～2g，马铃薯粉20～40g，琼脂粉15～20g。
[0012]进一步地，步骤S2中所述固体培养基组成为：每升水中加入红糖30g，60mmol/L愈创木酚0.3mL，牛肉浸膏2g，甘氨酸15g，MgSO
4 1.5g，KH2PO
4 2g，马铃薯粉30g，琼脂粉15g。
[0013]进一步地，S4所述固体培养基中培养是指置于培养箱中26～36℃连续黑暗条件下培养18d；
[0014]进一步地，S4所述固体培养基中培养是指置于培养箱中30～36℃连续黑暗条件下培养18d；
[0015]进一步地，S3所述菌块为直径5mm的圆形菌块。
[0016]上述暗褐脉柄牛肝菌菌丝体在抑制烟草花叶病毒上的应用，其具体的用法如下：
[0017]S1、暗褐脉柄牛肝菌固体培养18d后，在培养基表面形成一层可剥离的菌丝层，用取样勺仔细从培养基上将菌丝层刮取下来，冷冻干燥，研磨粉碎，得到暗褐脉柄牛肝菌的菌丝体干粉；
[0018]S2、在超净工作台上，将暗褐脉柄牛肝菌的菌丝体干粉和磷酸缓冲液按重量1:1比例混合，得磷酸混合液40～60mmo/L，pH值为7.5～7.7；混合液放入高速离心机中，在10000～15000rpm下离心30min，收集上清液，用水稀释到30～70μg/mL即为目标提取液；
[0019]S3、取长到8～10片真叶的患烟草花叶病毒烟草进行整株喷雾72h，喷量为500mL/h，每隔8h喷一次。
[0020]有益效果：
[0021](1)培养基成分简单，使用了易获取的碳源(红糖)、氮源(牛肉浸膏)以及一些无机盐(MgSO4、KH2PO4)；
[0022](2)利用该固体培养基制成的菌丝体，菌落菌丝浓密，生长势旺盛，边缘整齐且有同心环，具有极强的繁殖能力；
[0023](3)该培养基培养出的暗褐脉柄牛肝菌菌丝体通过降解木质纤维素作为碳源、激活愈创木酚氧化酶和保持漆酶活性，使菌丝生长速度快，同时通过与愈创苯酚和甘氨酸的协同作用，有效防治烟草花叶病毒，其抑制率可达96.33％，为真菌抗烟草花叶病毒提供研究方向。
具体实施方式
[0024]下面结合实施例对本专利技术作出进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0025]1一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养最佳营养元素、温度及诱导因子含量的确认
[0026]1.1按营养元素考核结果筛选，确定最佳营养元素
[0027]选择四因素三水平的L9(34)正交试验对培养基的初始浓度进行优化，如表1。各营养元素加入的量如表2，根据试验结果选择营养元素最佳配比。
[0028]十字交叉法：该方法是将直尺经过菌落生长中心，测得相互垂直的两次菌落直径的长度，再求平均值算出平均直径。
[0029]表1L9(34)正交试验表
[0030][0031][0032]表2L9(34)正交试验设计因素水平表
[0033][0034]实施例1
[0035]一种暗褐脉柄牛肝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将红糖、愈创木酚、牛肉浸膏、甘氨酸、MgSO4、KH2PO4、马铃薯粉和琼脂粉加入到水中，煮沸至琼脂粉完全融化，得固体培养基，将培养基分装于瓶中，灭菌，待冷却凝固后得到固体培养基；S2、分离暗褐脉柄牛肝菌菌种，取子实体菌柄与菌盖交界的中间部位2～3mm的菌肉组织，将该组织放入PDA培养基中，直至菌丝完全覆盖整个培养皿，在菌落外围将菌丝打成菌块；S3、在无菌环境下，将菌块接种至固体培养基，置于培养箱中培养，得到暗褐脉柄牛肝菌的菌丝体。2.根据权利要求1所述的一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培养方法，其特征在于，步骤S1中所述固体培养基组成为：每升水中加入红糖10～30g，50～60mmol/L愈创木酚0.2～0.4mL，牛肉浸膏1～3g，甘氨酸10～20g，MgSO
4 0.5～1.5g，KH2PO
4 1～2g，马铃薯粉20～40g，琼脂粉15～20g。3.根据权利要求2所述的一种暗褐脉柄牛肝菌的固体培...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾念开，张絮，韩云霄，田润，秦华志，邓慧，赵润祥，潘章超，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：