一种经血干细胞分离方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种经血干细胞分离方法及其应用，所述分离方法包括：将经血与酶混合，孵育；将经酶处理后的经血样本稀释后加至分离液上方，梯度离心，得到白膜层、血浆层、分离液层和沉淀；取白膜层细胞经PBS清洗后与间充质干细胞培养基混合，得到白膜层细胞悬液；取离心后的沉淀，将沉淀与胶原酶I和/或红细胞裂解液混合，离心，使用间充质干细胞培养基重悬，得到处理后沉淀的细胞悬液；混合白膜层细胞悬液和处理后沉淀的细胞悬液，分选SUSD2阳性的细胞。本发明专利技术所述分离方法既能提高分离效率，又能提高原代细胞纯度，细胞传至P1表型鉴定即可合格，缩短了细胞纯化所需的时间，适用于临床应用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种经血干细胞分离方法及其应用


[0001]本专利技术属于干细胞制备
，涉及一种经血干细胞分离方法及其应用。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新能力且能多向分化的成体干细胞，从围产期组织及骨髓、脂肪等成体组织中获得的MSCs已经被广泛应用到疾病的治疗研究中。
[0003]2007年，Musina等人首次从健康女性的月经血中分离并鉴定了一种新型的干细胞；2008年，Hida及其同事也成功从月经血中获得了具有多重分化功能的干细胞，并将其用于修复受损的心肌组织，这种细胞被命名为经血源子宫内膜干细胞(menstrual blood
‑
derived endometrial stem cells，MenSCs)，是一种全新来源的间充质干细胞。MenSCs具有增殖速度快、分化潜能高、免疫原性低及不易成瘤等优点，除此之外，MenSCs可以从月经杯收集的月经血中分离获取，能够避免取材时对人体的伤害，也能规避严重的伦理问题，因此在再生医学、疾病治疗等领域拥有广阔的应用前景。有报道证实，MenSCs移植在治疗宫腔粘连、卵巢早衰、杜氏肌营养不良或充血性心力衰竭等疾病时均取得了较好的结果。
[0004]月经是指伴随卵巢周期性变化而出现的子宫内膜周期性脱落出血现象。月经血呈暗红色，除血液外，还包含子宫内膜碎片、宫颈黏液及脱落的阴道上皮细胞等成分。使用月经杯在体外收集月经血是一种可以快速、方便地获取大量血液样本的方式，但血液从宫腔内流出时，会携带一定量的宫颈黏液。宫颈黏液是一种主要成分为血浆蛋白、糖蛋白、氯化钠和水的水凝胶，受卵巢性激素的影响，由宫颈腺细胞分泌，其物理、化学性质和分泌量均存在明显的周期性改变。女性排卵后，在孕激素的作用下，宫颈黏液会变得黏稠和浑浊。因此在宫颈黏液的作用下，收集到的月经血样本可能会较为稠厚，难以与PBS混合均匀，从而影响MenSCs的密度分离和培养。
[0005]目前MenSCs分离方法最常使用的是Ficoll密度梯度分离法，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而实现分离。一般情况下会将月经血样本用PBS稀释后，加入Ficoll密度分离液中，进行密度梯度离心，取离心后的白膜层细胞进行贴壁培养，通过更换培养液和传代得到纯化的MenSCs。
[0006]Ficoll密度分离方法操作简单且耗时短，但是分离效率较为低下，其原因在于：月经血中含有大量的宫颈黏液，经血稠厚会影响到密度梯度分离的效果，从而导致白膜层目的细胞数量较少，严重时甚至无法分离出细胞。与此同时，密度梯度离心后，还有大量的目的细胞在离心后沉降到底部沉淀中，与血细胞一起被废弃，造成细胞的大量浪费，增加实验成本。另外密度梯度分离法得到的细胞往往仍然含有血细胞、上皮细胞等非目的细胞，血细胞等悬浮细胞的存在会影响MenSCs的贴壁，上皮细胞等贴壁细胞使原代MenSCs的纯度较低，且只能通过培养基筛选和连续传代的方法对细胞进行纯化，难以在短时间内得到大量纯度较高、均一性较好的MenSCs。
[0007]因此，我们迫切需要一种既能提高MenSCs分离效率、又能提高原代细胞纯度的分
离方法，这是加快MenSCs移植治疗技术向临床转化的第一步。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种经血干细胞分离方法及其应用。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种经血干细胞分离方法，所述分离方法包括：
[0011](1)经血黏液预处理：将经血与酶混合，孵育；
[0012](2)白膜层细胞分离：将经步骤(1)处理后的经血样本加至分离液上方进行离心，得到白膜层、血浆层、分离液层和沉淀，取白膜层细胞与间充质干细胞培养基混合；
[0013](3)沉淀中干细胞分离：取步骤(2)离心后的沉淀，将沉淀与胶原酶I和/或红细胞裂解液混合，离心，使用间充质干细胞培养基重悬；
[0014](4)分选：将步骤(2)和步骤(3)所得产物混合，分选SUSD2阳性的细胞。
[0015]本专利技术公开了一种经血源子宫内膜干细胞的分离方法，既能提高分离效率，又能提高原代细胞纯度，分离方法简单，适用于临床应用。经血去黏液预处理操作，使宫颈黏液液化，从而改善密度梯度离心的效果，提高MenSCs分离效率。采用胶原酶I、红细胞裂解液处理底部沉淀，获取大量传统方法废弃掉的目的细胞。收集密度梯度离心后的白膜层和底部沉淀细胞进行磁珠纯化后培养。本专利技术P0收获的细胞总量平均可达到白膜层细胞数量的4倍，提高MenSCs的分离数量，使用SUSD2分选，能够提高P0细胞的纯度。细胞培养至P1代时，表型鉴定结果合格，符合间充质干细胞鉴定标准。
[0016]优选地，步骤(1)所述酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明质酸酶、α
‑
淀粉酶或β
‑
淀粉酶中的任意一种或至少两种的组合；进一步优选为胰蛋白酶和糜蛋白酶的组合。
[0017]本专利技术创造性地发现，胰蛋白酶和糜蛋白酶在上述效果上具有一定的协同效果。
[0018]优选地，所述经血与胰蛋白酶和糜蛋白酶的体积比为(5
‑
10):1:1。
[0019]其中(5
‑
10)中的具体点值均可选择5、6、7、8、9、10等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0020]优选地，所述胰蛋白酶的工作浓度为0.025
‑
0.05％，糜蛋白酶的工作浓度为0.25
‑
0.5mg/mL。
[0021]所述胰蛋白酶的工作浓度可以选择0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％等，所述糜蛋白酶的工作浓度可以选择0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0022]优选地，步骤(1)所述孵育的温度为36
‑
38℃，时间为20
‑
30min。
[0023]所述孵育的温度可以选择36℃、37℃、38℃等，时间可以选择20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0024]优选地，步骤(2)所述离心的离心力为400
‑
600xg，离心时间为15
‑
25min。
[0025]所述离心力可以选择400xg、420xg、440xg、460xg、480xg、500xg、520xg、540xg、560xg、580xg、600xg等，所述离心时间可以选择15min、16min、17min、18min、19m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种经血干细胞分离方法，其特征在于，所述分离方法包括：(1)经血黏液预处理：将经血与酶混合，孵育；(2)白膜层细胞分离：将经步骤(1)处理后的经血样本加至分离液上方进行离心，得到白膜层、血浆层、分离液层和沉淀，取白膜层细胞与间充质干细胞培养基混合；(3)沉淀中干细胞分离：取步骤(2)离心后的沉淀，将沉淀与胶原酶I和/或红细胞裂解液混合，离心，使用间充质干细胞培养基重悬；(4)分选：将步骤(2)和步骤(3)所得产物混合，分选SUSD2阳性的细胞。2.根据权利要求1所述的经血干细胞分离方法，其特征在于，步骤(1)所述酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明质酸酶、α
‑
淀粉酶或β
‑
淀粉酶中的任意一种或至少两种的组合；优选为胰蛋白酶和糜蛋白酶的组合；优选地，所述经血与胰蛋白酶和糜蛋白酶的体积比为(5
‑
10):1:1；优选地，所述胰蛋白酶的工作浓度为0.025
‑
0.05％，糜蛋白酶的工作浓度为0.25
‑
0.5mg/mL。3.根据权利要求1或2所述的经血干细胞分离方法，其特征在于，步骤(1)所述孵育的温度为36
‑
38℃，时间为20
‑
30min；优选地，步骤(2)所述离心的离心力为400
‑
600xg，离心时间为15
‑
25min；优选地，步骤(2)所述分离液包括羟乙基淀粉、泛影酸和水。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的经血干细胞分离方法，其特征在于，步骤(3)具体为取步骤(2)离心后的沉淀，将沉淀与胶原酶I混合，孵育，离心取沉淀与红细胞裂解液混合裂解，离心，使用间充质干细胞培养基重悬；优选地，所述胶原酶I的添加量为2
‑
4mg；优选地，所述沉淀与红细胞裂解液的体积为1:(3
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭季春，杨祖，郑贝贝，袁梦，张斯文，
申请(专利权)人：苏州元生细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：