一种三维诱导干细胞成骨分化的方法技术

本发明专利技术公开了一种三维诱导干细胞成骨分化的方法。所述方法包括：收集干细胞，制备成干细胞悬液，与多肽水凝胶工作液混合，接种于诱导培养基进行培养，进行诱导分化。本发明专利技术方法采用干细胞悬液与多肽水凝胶工作液共培养的方式诱导干细胞成骨分化，能够显著提高诱导效率，提高细胞贴壁率，降低细胞卷缩成团率，此外，明显缩短诱导时间，降低诱导成本，定向诱导成骨分化特异性强。成骨分化特异性强。成骨分化特异性强。

【技术实现步骤摘要】
一种三维诱导干细胞成骨分化的方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，涉及一种三维诱导干细胞成骨分化的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是祖细胞的一个异质亚群，具有自我更新能力和分化成各种特化细胞类型的潜能，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。目前，有大量的前临床和临床试验证实了间充质干细胞在各种疾病中的疗效，如心血管疾病、糖尿病、神经疾病、肾纤维化和女性生殖疾病。MSC可从各种组织中获得，如骨髓、外周血、脂肪组织、脐带和胎。2007年，第一次从经血中发现了一种新的MSCs来源，称为经血源性干细胞(menstrual blood
‑
derived stromal cells，MenSCs)。MenSCs具有样本来源丰富、无创取材、低免疫原性、无伦理问题等突出优势，是再生医学研究和临床转化的理想干细胞来源。研究表明MenSCs可向9种细胞系分化：成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经细胞、呼吸道上皮细胞、内皮细胞、肝细胞及胰腺细胞。2008年，Patel等进行类似的相关研究，成功地完成了MenSCs向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞的诱导分化，并对诱导效率进行了评估，验证了成骨分化检测是评估干细胞的分化能力的关键指标。
[0003]目前，成骨分化诱导主要以二维为主，虽然使用二维培养的研究简单且良好，但常常忽略了维度和微环境信号通路的巨大变化，并不能真实有效的模拟体内环境，且二维培养导致细胞之间不同的细胞
‑r/>细胞接触和相互作用。上述不利的影响细胞状态的方式进行分化培养导致分化困难并且需要很长时间。与二维培养相比，使用3D培养系统可以模拟生理条件，其基因、蛋白的表达以及其他生物学性能更接近于生命有机体，且3D培养系统对于再现体内条件和模拟组织的复杂性是必要的。3D培养可促进细胞培养的增殖和分化，但是目前培养方法操作复杂，增加操作过程，容易由于操作频繁导致样本污染，此外需要添加双抗，双抗影响细胞增殖，并且会与细胞发生交叉反应，干扰实验；接种过程中贴壁率高，并且需要先铺明胶预处理孔板；干细胞在诱导分化过程中，容易卷缩成团，从而导致结果失败；诱导效率低，茜素红染色效果不明显，显微镜下观察钙结石形成比例低。
[0004]例如CN105886461A公开了一种骨髓间充质干细胞向成骨分化的方法，所述方法将骨髓间充质干细胞接种含有PHAs支架的骨髓间充质干细胞生长培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，换成成骨分化培养液继续培养，每3天换液，共培养4周。采用本专利技术所述方法诱导培养骨髓间充质干细胞后，Von
‑
Kossa染色可见钙化结节，骨髓间充质干细胞经过传代后，采用本专利技术所述方法仍然可定向诱导分化成骨组织，但是此方法诱导时间长，诱导培养基成分复杂，成本高等问题。
[0005]CN111849878A公开了一种提高间充质干细胞成骨能力的方法，包括将间充质干细胞接种于含有10％胎牛血清的α
‑
MEM培养基中培养，采用0.2％胰酶消化传代；将上述得到的间充质干细胞接种于含有10％胎牛血清的α
‑
MEM培养基中培养，间充质干细胞密度大于90％时加入成骨诱导液和二甲双胍水溶液进行诱导，茜素红染色结果发现二甲双胍可以显著提高细胞钙矿化结节程度，二甲双胍可显著提高间充质干细胞成骨分化相关基因SIRT1、
ALP、COL1A1、RUNX2、BGLAP的表达，显著提高了间充质干细胞成骨分化能力，对于干细胞移植及骨生物学研究有十分重要的意义，但是此方法仍然存在诱导时间长，诱导培养基成分复杂，成本高等问题。
[0006]综上所述，目前诱导干细胞成骨分化的方法存在操作复杂，诱导效率低，诱导时间长，细胞容易卷缩成团等问题。如何提供一种诱导分化效果理想、定向诱导成骨分化特异性强的诱导分化成骨方法，提高诱导率，减少细胞卷缩成团，已成为目前细胞生物学
亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种三维诱导干细胞成骨分化的方法，解决了目前诱导干细胞成骨分化的方法存在操作复杂，诱导效率低，诱导时间长，细胞容易卷缩成团等问题，显著提高了诱导效率，有效减少了细胞卷缩成团，诱导分化效果理想、定向诱导成骨分化特异性强。
[0008]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种三维诱导干细胞成骨分化的方法，所述方法包括：收集干细胞，制备成干细胞悬液，与多肽水凝胶工作液混合，接种于诱导培养基进行培养，进行诱导分化。
[0010]本专利技术方法采用干细胞悬液与多肽水凝胶工作液共培养的方式诱导干细胞成骨分化，能够显著提高诱导效率，提高细胞贴壁率，降低细胞卷缩成团率，此外，明显缩短诱导时间，降低诱导成本，定向诱导成骨分化特异性强。
[0011]优选地，所述多肽水凝胶工作液含有水凝胶、多肽和FGF
‑
2。
[0012]优选地，所述水凝胶包括海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖或胶原蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
[0013]优选地，所述水凝胶中含有自组装短肽。
[0014]优选地，所述多肽包括成骨生长肽、人工合成的单链寡聚脱氧核苷酸或甲状旁腺素中的任意一种或至少两种的组合。
[0015]优选地，所述多肽水凝胶工作液中成骨生长肽的浓度为50
‑
250ng/mL。
[0016]上述50
‑
250中的具体点值可以选择50、60、70、80、90、100、110、150、180、190、200、220、250等。
[0017]优选地，所述多肽水凝胶工作液中FGF
‑
2的浓度为35
‑
175ng/mL。
[0018]上述35
‑
175中的具体点值可以选择35、50、70、80、90、100、110、150、160、170、172、175等。
[0019]优选地，所述多肽水凝胶工作液还含有海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖或胶原蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
[0020]优选地，所述干细胞悬液与水凝胶工作液的体积比为1:(1
‑
5)。
[0021]上述1
‑
5中的具体点值可以选择1、2、3、4、5等。
[0022]优选地，所述诱导培养基含有HG
‑
DMEM、瘦素、维生素C、地塞米松和血清代替物。
[0023]优选地，所述诱导分化的时间为10
‑
15天。
[0024]上述10
‑
15中的具体点值可以选择10、11、12、13、14、15等。
[0025]优选地，所述诱导培养基还含有核心结合因子、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子或胰岛素样生长因子中的任意一种或至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三维诱导干细胞成骨分化的方法，其特征在于，所述方法包括：收集干细胞，制备成干细胞悬液，与多肽水凝胶工作液混合，接种于诱导培养基进行培养，进行诱导分化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽水凝胶工作液含有水凝胶、多肽和FGF
‑
2；优选地，所述水凝胶包括海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖或胶原蛋白中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述水凝胶中含有自组装短肽。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多肽包括成骨生长肽、人工合成的单链寡聚脱氧核苷酸或甲状旁腺素中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述多肽水凝胶工作液中成骨生长肽的浓度为50
‑
250ng/mL；优选地，所述多肽水凝胶工作液中FGF
‑
2的浓度为35
‑
175ng/mL。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其特征在于，所述干细胞悬液与水凝胶工作液的体积比为1:(1
‑
5)。5.根据权利要求1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨祖，张花，王梽钰，
申请(专利权)人：苏州元生细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：