一种酶法制备瑞鲍迪甙J的方法技术

本发明专利技术提供了一种酶法制备瑞鲍迪甙J的方法，该方法以瑞鲍迪甙A为底物，在糖基供体存在下，在含有UDP

【技术实现步骤摘要】
一种酶法制备瑞鲍迪甙J的方法
[0001]本申请是CN201680089970.0的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种瑞鲍迪甙J的制备方法，特别涉及一种瑞鲍迪甙J的生物制备方法。

技术介绍

[0003]甜味剂是一类广泛应用于饮料及糖果等食品生产的食品添加剂，其既可以在食品的生产过程中添加，也可以在家庭烘焙时经过适当稀释作为蔗糖的替代品使用。甜味剂包括天然甜味剂和人工甜味剂，前者包括蔗糖、高果糖玉米糖浆、蜜糖等，后者包括阿斯巴甜、糖精等。甜菊糖是一类从植物甜菊中提取出来的天然甜味剂，目前已被广泛用在食品及饮料中。甜菊的提取物中具有包含瑞鲍迪甙在内的多种甜菊糖，天然提取的甜菊糖不同的批次成分差异较大，需要后续的提纯。
[0004]瑞鲍迪甙J在甜菊叶中甜菊糖的比例不超过0.5％，用传统提取的方法得到高纯度的瑞鲍迪甙J极其困难，限制了对瑞鲍迪甙J的深入研究，也阻碍了其商业化的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种酶法制备瑞鲍迪甙J的方法，该方法可以较低的成本、较短的周期生产出高纯度的瑞鲍迪甙J产品。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术采取如下技术方案：
[0007]一种酶法制备瑞鲍迪甙J的方法，以瑞鲍迪甙A为底物，在糖基供体存在下，在含有UDP
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糖基转移酶的重组细胞和/或其制备的UDP
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糖基转移酶的催化下，反应生成瑞鲍迪甙J。UDP
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糖基转移酶即尿苷二磷酸糖基转移酶，简称UGT，是已知的。
[0008]优选地，所述糖基供体为鼠李糖基供体。
[0009]更优选地，所述鼠李糖基供体为UDP
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鼠李糖。
[0010]优选地，所述UDP
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糖基转移酶为来自水稻(Oryza sativa)的UGT
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B。
[0011]优选地，所述来自水稻的UGT
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B的氨基酸序列与序列表中所示的序列2具有至少60％的一致性。
[0012]更优选地，所述来自水稻的UGT
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B的氨基酸序列与序列表中所示的序列2具有至少70％的一致性。
[0013]进一步地，所述来自水稻的UGT
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B的氨基酸序列与序列表中所示的序列2具有至少80％的一致性。
[0014]更进一步地，所述来自水稻的UGT
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B的氨基酸序列与序列表中所示的序列2具有至少90％的一致性。
[0015]根据一个具体实例，所述来自水稻的UGT
‑
B的氨基酸序列与序列表中所示的序列2完全一致。
[0016]根据本专利技术，可以使所述反应在温度4
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50℃以及pH 5.0
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9.0的水相体系中进行。优选地，反应在35
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45℃温度以及pH7.5
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8.5的水相体系中进行。更优选地，反应在温度40℃下进行，反应在pH 8.0下进行。
[0017]更优选地，反应在磷酸缓冲溶液中进行。
[0018]更优选地，反应体系含有UDP
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糖基转移酶的重组细胞和细胞通透剂，是反应在细胞通透剂的存在下进行。进一步地，所述细胞通透剂为甲苯，且甲苯在反应体系中的体积比浓度为1
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3％。更进一步地，甲苯的体积比浓度为2％。
[0019]更优选地，将反应所用全部原料加入到反应釜中，混合均匀后置于设定温度下，搅拌反应。反应完毕后，通过提纯处理即可获得达到使用要求的瑞鲍迪甙J产品。一个具体的提纯方方法是经包括树脂分离在内的后处理，按照该提纯方法，可获得纯度高达95％的瑞鲍迪甙J产品。
[0020]优选地，所述重组细胞为微生物细胞。
[0021]更优选地，所述微生物为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
[0022]由于以上技术方案的实施，本专利技术与已有技术相比具有如下优势：
[0023]本专利技术提供的酶法制备瑞鲍迪甙J的方法具有重要的应用价值。由于酶法生产的底物瑞鲍迪甙A可大量获得，瑞鲍迪甙J的产量不受原材料的限制，极大的降低了生产成本。此外，植物中的甜菊糖含量低，且有较多不同结构的甜菊糖，很难提取较纯的产品，与已有从甜菊叶中提取瑞鲍迪甙J的技术相比，采用本专利技术的酶法合成方法能够提供纯度更高的产品，必将推动对新型甜菊糖苷瑞鲍迪甙J的研究和应用。
具体实施方式
[0024]瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙J的结构式分别参见式I和II。
[0025][0026]本专利技术主要提供的瑞鲍迪甙J的合成路线如下：
[0027][0028]本专利技术所用的UGT
‑
B可以酶冻干粉形式存在或存在于重组细胞中。
[0029]UGT
‑
B的获得方法如下：
[0030]利用分子克隆技术、基因工程技术获得UGT
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B的重组大肠埃希氏杆菌(或其它微生物菌)表达菌株，然后将重组大肠埃希氏杆菌发酵，制备得到含有UGT
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B的重组细胞，或由上述重组细胞制备得到UGT
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B的冻干粉。
[0031]本专利技术所述的分子克隆技术和基因工程技术均是已知的。分子克隆技术可参见《分子克隆实验指南》第三版(J.沙姆布鲁克著，2005)。
[0032]采用基因工程技术构建本专利技术重组菌株的表达步骤如下：
[0033](1)(根据序列表中所示的序列1及序列2)基因合成所需的基因片段，连入pUC57载
体，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点；
[0034](2)通过双酶切、连接，将各基因片段插入表达载体pET30a相应的酶切位点中，使各基因置于T7启动子的控制之下；
[0035](3)将重组质粒转化进入大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)中，利用IPTG诱导目的蛋白表达，得到UGT
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B的重组大肠埃希氏杆菌表达菌株。
[0036]利用含有UGT
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B的重组大肠埃希氏杆菌表达菌株制备含有UGT
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B的重组细胞、UGT
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B的冻干粉的步骤如下：
[0037]以1％比例将含有UGT
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B的重组大肠埃希氏杆菌表达菌株接种到4ml液体LB培养基中，37℃振荡培养(200rpm)过夜，取过夜培养物以1％接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养(200rpm)至OD600值达到0.6
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0.8，加入终浓度0.4mM IPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞(8,000rpm，10min)，用5ml 2mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，获得所述重组细胞，进一步于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，10min)，收集上清液冻干24h，获得所述冻干粉。
[0038本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法制备瑞鲍迪甙J的方法，其特征在于：以瑞鲍迪甙A为底物，在糖基供体存在下，在含有UDP
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糖基转移酶的重组细胞和/或其制备的UDP
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糖基转移酶的催化下，反应生成瑞鲍迪甙J。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述糖基供体为鼠李糖基供体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述鼠李糖基供体为UDP
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鼠李糖。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述UDP
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糖基转移酶为来自水稻的UGT
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B。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述来自水稻的UGT
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B的氨基酸序列与序列表中所示的序列2具有至少60％的一致...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶军华，李国庆，王文霞，郑雷雷，朱春磊，梁晓亮，陈车翘，
申请(专利权)人：百事可乐公司，
类型：发明
国别省市：