一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法技术

本发明专利技术涉及药物合成领域，公开了一种一锅酶法制备L

【技术实现步骤摘要】
一种一锅酶法制备L
‑5‑
MTHF的方法


[0001]本专利技术涉及药物合成领域，尤其涉及一种一锅酶法制备L
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MTHF的方法。

技术介绍

[0002]L
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甲基四氢叶酸(L
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MTHF)是食物源天然叶酸的主要形式，也是人体血浆和血液循环中发现的唯一叶酸形式，被用于组织间的叶酸转运。L
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MTHF可在体内循环中直接被吸收和利用，不需要额外的代谢步骤，比合成叶酸具有更高的生物利用度。此外，最近的研究表明，L
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MTHF是唯一可以渗透通过血脑屏障的叶酸类药物，具有防治阿尔茨海默病的作用，同时也可以作为广谱抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂。所以，L
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MTHF是最具生物活性和功能的叶酸形式。美国、日本和欧洲已经批准将L
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MTHF作为一种食品添加剂添加到各种食品中，这也使得L
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MTHF的市场需求量剧增。
[0003]L
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MTHF含有两个手性碳原子，特别是C5和C6之间的双键加氢时，容易形成旋光异构体，包括6R
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MTHF(即D
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MTHF)和6S
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MTHF(即L
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MTHF)。其中(6S)构型的L
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MTHF是自然存在的唯一形式，具有良好的药效，而6R构型的D
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MTHF不能被人体吸收利用，无治疗保健作用。
[0004]L
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MTHF的合成主要以叶酸为前体，包括化学法、酶
‑
化学法、微生物发酵法等。
[0005]化学合成方法是现有工业生产中合成L
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MTHF使用较为普遍的方法。化学合成方法有催化加氢法、硼氢化钠还原法、连二亚硫酸钠还原法和二氢叶酸还原酶法等。如硼氢化钠还原法，该方法使用NaBH4作为还原剂，将叶酸还原生成THF消旋体混合物，然后分离进行甲基化获得L
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MTHF。硼氢化钠还原法具有的缺点是：
①
NaBH4具有强烈刺激性，极易燃烧，有安全隐患；
②
产物是外消旋混合物，分离困难；
③
生产步骤较多，生产较烦琐。
[0006]再如申请公布号为CN114874216A的中国专利提供了一种L
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甲基四氢叶酸的制备方法，也是通过化学法合成L
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MTHF。该专利合成L
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甲基四氢叶酸的技术方案为：以叶酸为原料，还原制得中间体6
‑
(R,S)
‑
四氢叶酸；然后将6
‑
(R,S)
‑
四氢叶酸经过手性拆分，制得中间体6
‑
S
‑
四氢叶酸盐；最后将中间体6
‑
S
‑
四氢叶酸盐在缓冲液中经过甲基化反应制得L
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甲基四氢叶酸。该专利提供方法将手性拆分提前在第二步，但仍然无法避免颇具难度的手性拆分步骤，另外，该方法步骤也较为繁杂，在工业应用中生产成本较高。
[0007]现有技术中，也有通过微生物发酵法制备L
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MTHF。该方法是依赖于能够在胞内积累较高浓度的叶酸和L
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MTHF的微生物，通过发酵制备获得L
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MTHF。一般通过自然界筛选、诱变育种和基因工程育种等方法获得高产菌株。但是，由于叶酸类化合物属于胞内代谢的辅酶因子，存在多重的动态平衡调节，所以，其胞内积累的浓度十分有限。已有报道的微生物菌株以及经过基因组改造的菌株，发酵生产L
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MTHF的水平都低于1.3mg/L。
[0008]现有技术中，还有通过酶法和化学法结合的方式制备L
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MTHF。酶
‑
化学法是依赖二氢叶酸还原酶(DHFR)法的活性，将二氢叶酸(DHF)还原成6S构型的四氢叶酸(6S
‑
THF)，随后采用化学法进行转甲基反应。但在酶催化体系中，首先存在的问题是DHFR的活性受到产物6S
‑
THF的抑制调节，其转化率受到一定限制，其次，6S
‑
THF稳定性差，极易造成损失，若再
进一步分离提取用于下一步的化学法甲基化反应，其产物得率低。
[0009]为了解决上述现有技术中的问题，本专利技术团队致力于开发出一种产率高、生产步骤简单、安全温和的方法制备L
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甲基四氢叶酸。

技术实现思路

[0010]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种一锅酶法制备L
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MTHF的方法。本专利技术提供方法为全酶法催化转化的方法，条件温和安全，同时，本专利技术方法采用一锅法制备工艺，步骤简单，并避免了中间产物分离问题及酶催化体系的产物抑制问题。本专利技术提供的一锅酶法制备L
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甲基四氢叶酸的工艺，具有高产率的特点，具有极大的应用价值和市场前景。
[0011]本专利技术的具体技术方案为：本专利技术提供了一种一锅酶法制备L
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MTHF的方法，包括以下步骤：往叶酸中加入二氢叶酸还原酶、四氢叶酸甲基转移酶，催化反应，得到L
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MTHF。
[0012]本专利技术采用一锅酶法制备工艺制备L
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甲基四氢叶酸。在本专利技术方法中，体系中的底物化合物(Ⅱ)，即叶酸，首先在二氢叶酸还原酶(DHFR)的催化下，发生不对称加氢反应，得到中间体化合物(Ⅲ)，即L
‑
四氢叶酸6S
‑
THF，后经四氢叶酸甲基转移酶(DmdA)催化得到具有光学纯的L
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MTHF。本专利技术一锅酶法可以避免中间产物分离的步骤，本方法中，产生的中间体6S
‑
THF现时转化为产物L
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MTHF，即产即用，并消除了产物抑制的缺点，本专利技术方法以10g/L的叶酸为底物进行催化反应10h，底物的转化率大于90％，可实现酶法的高效制备L
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MTHF。本专利技术合成工艺在公开文献中，尚未见报道。工艺路线如下所示：上述二氢叶酸还原酶为源于野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的XcaDHFR(SEQ IDNO.2，NCBI登录号为WP_011036024.1)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的LasDHFR(SEQ ID NO.4，NCBI登录号WP_014568348.1)、嗜碱耐盐性芽孢杆菌(Bacillus halodurans C
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125)的BhaDHFR(SEQ ID NO.6，NCBI登录号为WP_010899586.1)和人源(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种一锅酶法制备L
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MTHF的方法，其特征在于：包括以下步骤：往叶酸中加入二氢叶酸还原酶、四氢叶酸甲基转移酶，催化反应，得到L
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MTHF。2.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L
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MTHF的方法，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有>80％的同源性。3.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L
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MTHF的方法，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示序列具有>80％的同源性。4.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L
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MTHF的方法，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.6所示序列具有>80％的同源性。5.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L
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MTHF的方法，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小龙，朱林江，陆跃乐，王佳燕，朱勇刚，周斌，
申请(专利权)人：浙江工业大学浙江渚隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：