亚胺还原酶、突变体及其在四氢-β-咔啉类衍生物合成中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体为胺还原酶、突变体及其在四氢

【技术实现步骤摘要】
亚胺还原酶、突变体及其在四氢
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β
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咔啉类衍生物合成中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及胺还原酶、突变体及其在四氢
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β
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咔啉类衍生物合成中的应用。

技术介绍

[0002]四氢
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β
‑
咔啉类(THβCs)化合物是一类具有多种药理活性的氮杂环生物碱，在药物和具有生物活性的天然产物中广泛存在，例如利血平，阿马碱，他达拉非，四氢哈尔明碱，松香烃等均含有该骨架片段。其中，含有1
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位取代基的片段因其显著的药用特性而尤为重要；例如，Tadalafil和AZD
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9496分别用于治疗勃起功能障碍和抗乳腺癌的药物先导(I期临床试验)：
[0003][0004]具有药学意义的THβCs类化合物
[0005]THβCs类化合物因其复杂的分子结构和与之相关的丰富生物活性引起了合成界的极大关注，已经报道了许多关于这些结构完全合成的开创性研究。其中，THβCs的不对称合成方法的发展仍然是一个重要的挑战，尽管前任已经开发了许多方法，包括手性辅助剂、过渡金属催化剂、有机催化剂等的使用，但同时也存在反应条件苛刻，贵金属的使用与残留等局限性。因此，开发一种绿色高效，反应条件温和的合成方法显得尤为重要。
[0006]生物法制备手性胺通常以酶为催化剂，拆分外消旋体或者直接催化手性胺的不对称合成。相较于传统的化学合成方法，生物酶法具有良好的对映选择性，可以在温和的环境中参与反应等优势，被看作金属催化剂的潜在绿色替代品。随着生物技术的发展和生物酶催化手性胺合成的研究的深入，越来越多催化手性胺生成的新酶被挖掘，目前催化手性胺不对称合成的生物酶主要包括转氨酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶和单胺氧化酶等。其中，亚胺还原酶(IRED)可催化亚胺不对称合成相应的手性胺，理论产率可达100％，且具有催化合成手性仲胺和叔胺的独特优势，也逐渐成为国内外研究的热点。
[0007]与许多其他N
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杂环反应类似，迄今为止，通过IRED合成THβCs仅限于立体阻碍较小的1
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烷基产物，1
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位季碳取代的THβCs的生物合成方法尚无报道，而1
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芳基
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THβCs的生物催化方法仅在单胺氧化酶(MAO
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N)与非选择性化学还原剂的化学酶解、酶法Pictet
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Spengler反应中获得成功。然而，这些方法中的大多数存在酶活性不高，转化率低，e.e.值通常不太令人满意等问题；因此，开发更高效系统的方法，特别是那些能够催化生成(S)
‑1‑
位大位阻
取代的产品的方法，具有重要意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的问题和不足，提供一种胺还原酶及其突变体，以及在四氢
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β
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咔啉类衍生物合成中的应用。
[0009]本专利技术包括：首先提供来源于Amycolatopsis thermoflava的亚胺还原酶；其次通过蛋白质工程技术对野生型亚胺还原酶进行分子改造，获得活性和立体选择性显著提高的亚胺还原酶突变体；然后以所述亚胺还原酶或其突变体的游离酶或重组表达转化体作为催化剂，不对称还原二氢
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β
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咔啉类(DHβCs)(简记为化合物1)生成(S)
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四氢
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β
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咔啉类(THβCs)衍生物(简记为化合物2)；THβCs衍生物可作为中间体进一步用于合成手性药物。
[0010]本专利技术第一方面：提供一种野生型亚胺还原酶，记为IRED
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At，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。其对应编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；该亚胺还原酶可以高选择性还原二氢
‑
β
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咔啉类(DHβCs)(化合物1)。
[0011]本专利技术利用生物信息学手段分析预测可能对化合物1具有明显还原活性的亚胺还原酶，并将其基因进行克隆表达，构建重组大肠杆菌。通过测定重组表达的亚胺还原酶对化合物1的活性及选择性，对一系列候选的亚胺还原酶进行筛选，最终获得催化性能较佳，选择性较高的亚胺还原酶，其来源于Amycolatopsis thermoflava。
[0012]本专利技术第二方面，提供上述多种亚胺还原酶突变体，也可称之为重组亚胺还原酶。本专利技术对所述亚胺还原酶IRED
‑
At的氨基酸序列进行分子改造，提供多种亚胺还原酶突变体。所述亚胺还原酶突变体是在如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代一个或几个氨基酸形成的稳定性提高的衍生蛋白质。
[0013]具体地，是将如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中第118位甲硫氨酸、第120位脯氨酸及第174位苯丙氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。
[0014]进一步地，所述亚胺还原酶突变体具有如下序列中的一种：
[0015](1)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸；
[0016](2)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第120位脯氨酸替换为甘氨酸；
[0017](3)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第120位脯氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸或精氨酸；
[0018](4)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第120位脯氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸或精氨酸，第174位苯丙氨酸替换为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸。
[0019]本专利技术第三方面，还提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述野生型亚胺还原酶或其突变体。并提供核酸的重组表达载体，具体通过本领域常规的方法将所述亚胺还原酶IRED
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At或其突变体核酸克隆到各种表达载体上而得到重组表达载体。所述表达载体包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、噬菌体或是病毒载体等，优选载体为质粒pET28a。
[0020]本专利技术第四方面，还提供一种包含所述亚胺还原酶基因或所述亚胺还原酶突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达
载体可稳定地自行复制，并且其所携带的亚胺还原酶IRED
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At或其突变体的基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即可获得本专利技术优选的重组表达转化体。例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种野生亚胺还原酶IRED
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At在催化合成(S)
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四氢
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β
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咔啉类化合物中的应用，其特征在于，所述亚胺还原酶IRED
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At的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述突变体是将其如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中第118位甲硫氨酸、第120位脯氨酸及第174位苯丙氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。3.根据权利要求2所述亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体具有如下序列中的一种：(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸；(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第120位脯氨酸替换为甘氨酸；(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第120位脯氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸或精氨酸；(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第120位脯氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸或精氨酸，第174位苯丙氨酸替换为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸。4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的亚胺还原酶IRED
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At，以及如权利要求2或3中所述亚胺还原酶突变体之一种。5.一种包含如权利要求4所述核酸的重组表达载体。6.一种包含如权利要求5所述重组表达载体的重组表达转化体。7.一种亚胺还原酶催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：(1)培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有如权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：陈芬儿，黄则度，李奕潼，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：