一种生物酶法水解核苷的方法技术

本发明专利技术提供了一种生物酶法水解核苷的方法，以嘌呤核苷或者嘧啶核苷为原料，在核苷水解酶的催化作用下发生反应，制得对应碱基，反应过程中的温度为20

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶法水解核苷的方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，涉及一种核苷，具体来说是一种生物酶法水解核苷的方法。

技术介绍

[0002]核苷是一类由嘌呤碱基或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖组成的化合物。核苷的水解产物主要包括腺嘌呤，鸟嘌呤，次黄嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶等碱基，它们在食品、化妆品、医药等多个行业有着广泛的用途。例如鸟嘌呤可用于化妆品着色剂、颜色添加剂、遮光剂(Panush S,et al.Subtle patina metallic coatings contain guanine.EP439112)。次黄嘌呤具有降血压、平喘、治疗痛风等药理活性(宋艳等.兔心肌中次黄嘌呤纯化工艺的优化.中国生化药物杂志,2012.33(06))。在农业生产上，次黄嘌呤具有杀菌作用，可用作农药中间体。胞嘧啶可用于合成抗艾滋病药物及抗癌药物。由于嘌呤碱基和嘧啶碱基用途广泛，因而其生产研究越来越受到重视。
[0003]目前，嘌呤碱基和嘧啶碱基具有工业化前景的生产方法主要包括酶水解法和化学合成法。其中化学合成通常需要高温高压的环境，还会用到大量有毒害的试剂，更重要的是底物转化率不高，限制了此类物质的生产。酶水解法是以核苷水解酶为催化剂，以多种核苷为原料，经一步酶促反应切割核苷的糖苷键获得对应碱基。核苷水解酶根据偏好的底物可进行分类，常见的有胞苷
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尿苷核苷水解酶、肌苷
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腺苷
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鸟苷核苷水解酶等。Maciej等人从黄羽扇豆种子中纯化出偏好鸟苷
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肌苷的核苷水解酶，在添加二价阳离子情况下酶活性达到最大(Maciej,et al.Calcium
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stimulated guanosine
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inosine nucleosidase from yellow lupin(Lupinus luteus).Phytochemistry.2006,67(14))。孟等鉴定了谷氨酸棒杆菌来源三种核苷水解酶的酶学性质，发现它们都能够水解腺苷、胞苷、鸟苷、肌苷和尿苷，但底物偏好性有差异(孟燕等.谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的酶学性质研究.食品与发酵工业,2022)。但是，目前报道的核苷水解酶的最适工作pH都接近中性，这非常不利于底物溶解。此外，水解反应的转化率很难超过95％，增加了下游分离纯化的难度。
[0004]因此，研发一种能在酸性环境下生物酶法高效彻底水解核苷的方法是非常有必要的。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种生物酶法水解核苷的方法，所述的这种生物酶法水解核苷的方法要解决现有技术中水解核苷的转化率很难超过95％，增加了下游分离纯化难度的技术问题。
[0006]本专利技术提供了一种生物酶法水解核苷的方法，以嘌呤核苷或者嘧啶核苷为原料，在核苷水解酶的催化作用下发生反应，制得对应碱基，反应过程中的温度为20
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50℃，pH为3.0
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6.0，所述反应在CaCl2或Ca(HCO3)2存在的条件下进行，CaCl2或Ca(HCO3)2的浓度为5
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50mM，所述嘌呤核苷或者嘧啶核苷的浓度为100
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400mM；
[0007]所述核苷水解酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：
[0008](1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0009](2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0010](3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
[0011]本专利技术中所使用的各种酶的具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化酶细胞，可以是未经纯化的粗酶形式、也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
[0012]本专利技术核苷是指嘌呤核苷或嘧啶核苷，包含腺苷，鸟苷，肌苷，胞苷，尿苷。
[0013]本专利技术核苷水解酶同源序列还包括与本专利技术所公开的基因序列有至少83％、91％、97％或98％序列相似性。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法、Needleman
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Wunsch全局比对法、Smith
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Waterman局部比对法、Pearson和Lipman相似性搜索法、Karlin和Altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。虽然并不是所有来源的核苷水解酶都具有本专利技术所主张的效果，但是来自Trypanosoma cruzi strain CL Brener和Trypanosoma conorhini的两个不同来源核苷水解酶都被证实具有效果，本领域技术人员可以知晓，本专利技术公开的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列以及与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子编码的蛋白质具有良好的催化效率。
[0014]本专利技术首次筛选到了具有优异水解转化率和催化活性的两种嗜酸核苷水解酶，分别来自Trypanosoma cruzi strain CL Brener和Trypanosoma conorhinia。专利技术人经过比较多种微生物来源的核苷水解酶的活性，证实与Trypanosoma conorhinia来源核苷水解酶具有75％以上氨基酸序列相似性的多种核苷水解酶均可以催化水解反应，只是水解转化率上有高低不同。
[0015]本专利技术所需核苷水解酶的一个实施例中制备方法如下：
[0016](1)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列分别连接质粒中，得到重组质粒，然后转化至BL21(DE3)，得到重组菌；
[0017](2)培养重组菌，诱导表达重组蛋白，利用高压匀浆机破碎收集菌体，通过镍离子亲和层析柱纯化蛋白。
[0018]本专利技术的一种实施方式中，重组菌以pET
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28a(+)为表达载体。
[0019]本专利技术的一种实施方式中，重组菌以BL21或Rosetta为宿主菌。
[0020]本专利技术构建的方法实现了在酸性条件下完全水解嘌呤核苷转化为对应碱基，对嘧啶核苷的水解率也超过95％。
[0021]本专利技术的优点在于，本专利技术核苷水解酶可在酸性环境下彻底催化水解多种核苷形成相应碱基，酸性环境增大了底物的溶解度。对体系酶添加量、反应温度、pH和金属离子浓度进行优化，确立最佳反应条件，提高产量。本专利技术的生物酶法水解核苷可以缩短生产周期，仅需要6
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12h即可获得产物，并且可以避免产物浓度低，分离纯化难度大，生产周期长，产品纯度不高等问题。
conorhinia来源核苷水解酶0.5
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1.0g/L，总体积20mL，40
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50℃，pH 5.0，反应时间为12h，得到产物鸟嘌呤。
[0038]按实施例3的体系，用高效液相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物酶法水解核苷的方法，其特征在于，以嘌呤核苷或者嘧啶核苷为原料，在核苷水解酶的催化作用下发生反应，制得对应碱基，反应过程中的温度为20
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50℃，pH为3.0
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6.0，所述反应在CaCl2或Ca(HCO3)2存在的条件下进行，CaCl2或Ca(HCO3)2的浓度为5
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵成源，李志敏，李宗霖，徐文杰，杨思豪，黄健淇，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：