一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法技术

本发明专利技术提供一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法，所述制备方法在发酵培养阶段进行如下控制：(1)发酵初期菌型为梭形，控制甲醇浓度为5～10g/L；(2)当菌体出现二分裂时，控制甲醇浓度为5～10g/L；(3)当菌体的极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/L；当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/L；当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/L，之后停止发酵。本发明专利技术的制备方法能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累PQQ产物的速率，提高了PQQ发酵水平，降低了其生产成本。本。本。

【技术实现步骤摘要】
一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，涉及一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法。

技术介绍

[0002]吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)，是生物体内参与脱氢酶氧化还原反应的辅酶，参与呼吸链电子传递，具有促进机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细胞对毒性和辐射等极端条件耐受性的功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。
[0003]PQQ虽然广泛存在于自然界中，但哺乳动物自身却不合成。其中植物含量低、提取成本太高，不适合工业化生产；化学合成法反应复杂，副产物多，成本较高，目前国内外PQQ的生产大多采用微生物发酵法。微生物发酵法有如下优点：(1)产品为天然产物，生物活性好，易于人体吸收；(2)原料来源广泛，利于工业化生产。
[0004]提高PQQ的发酵产量主要从两个方面进行优化：一是通过自然筛选、诱变育种或基因工程等手段选育出PQQ高产菌株，二是优化发酵培养基和发酵工艺，提高菌株的生长和产物合成水平。确定生产菌株及发酵培养基后，在摇瓶及发酵罐实验阶段可通过单因素等统计学的方法来进行优化，然而在生产上利用这一手段去优化时情况较复杂且工作量大，微生物发酵周期长，发酵结果不稳定，重复性低，效率较低。
[0005]CN106282044B公开了一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法，该专利技术公开的培养基以甲醇为单一碳源，发酵过程补料工艺粗放简陋，不易于控制，最终PQQ发酵浓度虽然达到了1783mg/L，但是甲醇消耗较多，转化率较低。
[0006]CN112375792A公开了一种生物法制造PQQ的方法，该专利技术公开了一种利用生丝微菌发酵生产PQQ的工艺，通过在培养过程中补加香菇多糖、枸杞多糖、大豆异黄酮等额外组分，促进菌体的生长和PQQ产量的提高，最终PQQ发酵浓度达到340.5mg/L，OD650达到25，该专利技术通过补料提高了PQQ的发酵水平，但整体产量较低，发酵成本较高，不利于工业化推广。
[0007]因此，在本领域中，期望开发一种既能够提高产量，又能够降低发酵成本的PQQ生产方法。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法。本专利技术的制备方法能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累PQQ产物的速率，提高了PQQ发酵水平，降低了其生产成本。
[0009]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]本专利技术提供一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将生丝微菌经菌种活化、摇瓶培养、种子培养后接种到发酵培养基进行发酵培养，在发酵培养阶段进行如下控制：
[0011](1)发酵初期菌型为梭形，控制甲醇浓度为5～10g/L；
[0012](2)当菌体出现二分裂时，控制甲醇浓度为5～10g/L；
[0013](3)当菌体的极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/L；当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/L；当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/L，之后停止发酵。
[0014]本专利技术中，专利技术人在研究过程中发现，当生丝微菌的极生菌丝的长度维持约为2～5倍菌体长度的阶段越长，产物PQQ的比产率越高，并据此专利技术了本专利技术的发酵方法，能够有效延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高了生丝微菌积累PQQ产物的速率，提高了PQQ发酵水平，降低了其生产成本。
[0015]在本专利技术中，通过根据菌体菌型调整甲醇浓度，使得延长极生菌丝长度约为2～5倍菌体长度的时间，从而提高生物量和产物产量。本专利技术的特征在于，在发酵培养基进行发酵培养阶段。
[0016]在本专利技术中，所述菌体的菌型是通过OLYMPUS CX23显微镜观察获知。
[0017]在本专利技术中，发酵初期菌型为梭形，此时极生菌丝长度为约1倍菌体长度，此时控制甲醇浓度为5～10g/L，例如5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L。如果在该时期甲醇浓度低于5g/L，则菌体生长速度缓慢，菌浓OD
650
较低，造成PQQ产量偏低，如果甲醇浓度高于10g/L，则对菌体产生毒害作用，抑制菌体生长，造成PQQ产量偏低。
[0018]经过发酵初期后，菌体会大量出现二分裂，在菌体出现二分裂阶段也是控制甲醇浓度为5～10g/L，例如5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L。如果在该时期甲醇浓度低于5g/L，则菌体生长速度缓慢，菌浓OD
650
较低，造成PQQ产量偏低，如果甲醇浓度高于10g/L，则对菌体产生毒害作用，抑制菌体生长，造成PQQ产量偏低。
[0019]而后菌体的极生菌丝长度达到2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/L，例如3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L或6g/L。如果在该时期甲醇浓度低于3g/L，则会碳源不足，从而影响菌体生长和产物合成，造成PQQ产量偏低，如果甲醇浓度高于6g/L，则会抑制PQQ分泌至培养基，造成PQQ产量偏低。
[0020]当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/L，例如0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L或1g/L，如果在该时期甲醇浓度低于0.5g/L，则会碳源不足，从而影响菌体生长和产物合成，造成PQQ产量偏低，如果甲醇浓度高于1g/L，则会抑制PQQ分泌至培养基，造成PQQ产量偏低。
[0021]当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/L，例如0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L或0.1g/L等，之后停止发酵。如果在该时期甲醇浓度高于0.5g/L，则会造成PQQ被消耗，产量偏低，并且造成发酵液中甲醇残留，可能影响后期发酵液提炼。
[0022]优选地，步骤(1)中通气量为0.6～0.8vvm(例如0.65vvm、0.7vvm或0.75vvm)，压力控制在0.05～0.06MPa(例如0.055MPa、0.058MPa或0.06MPa)，转速为120～140rpm(例如120rpm、125rpm、130rpm或135rpm)，pH 6.5～7.0(例如6.5、6.7、6.9或7.0)，温度为25～35℃(例如25℃、28℃、30℃、33℃或35℃)。
[0023]优选地，步骤(2)中通气量为0.8～1.4vvm(例如0.85vvm、0.9vvm、1.0vvm、1.2vvm或1.3vvm)，压力控制在0.06～0.08MPa(例如0.065MPa、0.07MPa或0.075MPa)，转速为200～250rpm(例如220rpm、230rpm或240rpm)，pH 6.5～7.0(例如6.5、6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种吡咯喹啉醌的发酵制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将生丝微菌经菌种活化、摇瓶培养、种子培养后接种到发酵培养基进行发酵培养，在发酵培养阶段进行如下控制：(1)发酵初期菌型为梭形，控制甲醇浓度为5～10g/L；(2)当菌体出现二分裂时，控制甲醇浓度为5～10g/L；(3)当菌体的极生菌丝长度为2～5倍菌体长度时，控制甲醇浓度3～6g/L；当菌体的极生菌丝长度为大于5倍菌体长度且小于等于7倍菌体长度时，控制甲醇浓度0.5～1g/L；当菌体的极生菌丝长度超过7倍菌体长度时，控制甲醇浓度≤0.5g/L，之后停止发酵。2.根据权利要求1所述的发酵制备方法，其特征在于，步骤(1)中通气量为0.6～0.8vvm，压力控制在0.05～0.06Mpa，转速为120～140rpm，pH 6.5～7.0，温度为25～35℃。3.根据权利要求1或2所述的发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中通气量为0.8～1.4vvm，压力控制在0.06～0.08MPa，转速为200～250rpm，pH6.5～7.0。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的发酵制备方法，其特征在于，步骤(3)中通气量为1.4～2.0vvm，压力控制在0.05～0.06MPa，转速180～200rpm，pH6.5～7.0。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的发酵制备方法，其特征在于，所述生丝微菌为甲醇利用型脱单生丝微菌；优选地，所述甲醇利用型脱单...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈加彬，段然，郑文煌，王炳荣，陈必钦，
申请(专利权)人：内蒙古金达威药业有限公司厦门金达威集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：