一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂及方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体公开了一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂及方法。本发明专利技术以猪星状病毒5型毒株的ORF1ab基因的高度保守区作为靶基因，经鉴定灵敏性后筛选出一对PCR引物，并据此设计合成TaqMan探针，制备用于检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂。经验证，除PAstV

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂及方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂及方法。

技术介绍

[0002]猪星状病毒(Porcine Astrovirus，PAstV)于上世纪80年代通过电镜检查发现。有文献报道，在健康的肥育猪中，PAstV的阳性率可达80％，而在有腹泻病症的农场中PAstV的阳性率甚至高达95.9％，表明猪对PAstV非常易感。目前已发现的猪星状病毒基因型共有5种(PAstV 1
‑
5)，序列分析表明五种基因型之间差异很大，基因组彼此间同源性只有40％左右，这也反映出PAstV间巨大的遗传差异。
[0003]2011年，研究者在加拿大养猪场成年猪盲肠内粪便标本中发现一种新型PAstV，这种PAstV无法用病毒通用引物检测，因为这株病毒并不存在多种病毒内均有的高度保守的s2m茎环结构。对该毒株进行系统发育分析发现，其在哺乳动物病毒科中形成了一个独特的谱系，与经典型的PAstV
‑
1仅有25％
‑
30％的氨基酸同源性，且与其他3种PAstV基因型也存在一定的遗传距离，因而将其命名为PAstV
‑
5。在加拿大之后，美国和中国也相继发现了PAstV
‑
5的存在。
[0004]据报道，国内第一株PAstV
‑
5(KP747574)的序列于2015年在健康家养仔猪中检测到，之后在四川野猪和湖南猪只中也发现了PAstV
‑
5的存在。有趣的是，国内发现的3株PAstV
‑
5均未分布在同一进化枝上，其中，湖南检出的PAstV
‑
5与美国PAstV
‑
5的关系更为密切。目前有关PAstV
‑
5的研究报道较少，对于PAstV
‑
5的遗传多样性和在国内不同PAstV基因型的流行趋势仍不清晰，且临床上缺少快速、准确鉴定猪星状病毒5型的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、准确检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR方法。
[0006]同时，本专利技术还提供一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂，提高检测的敏感性、特异性和稳定性。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂，包括：荧光定量PCR引物和探针；所述荧光定量PCR引物的序列如下所示：
[0009]Forward 1：5
’‑
AATGTGCGTGTGAAAGAGCG
‑3’
；
[0010]Reverse 1：5
’‑
CATCATAGCGGGTCCAGTCC
‑3’
。
[0011]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述探针的序列如下所示：
[0012]Probe：5
’‑
(FAM)ACAACGCCTGGCTTCAACCGGAGCA(BHQ1)
‑3’
。
[0013]所述探针为TaqMan探针，探针的5
’
端标记FAM荧光报告基团，3
’
端标记BHQ1荧光淬灭基团。
[0014]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述试剂还包括逆转录酶、逆转录反应缓冲液、DNA聚合酶、扩增反应缓冲液等中的一种或多种。
[0015]作为本专利技术一种优选的实施方案，所述试剂还包括阴性对照、阳性对照、标准品(如系列标准品，不同浓度或拷贝数)等中的一种或多种。
[0016]一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
[0017](1)以待测样本中RNA为模板进行逆转录，得到cDNA；
[0018](2)以cDNA模板，加入荧光定量PCR引物和探针，进行实时荧光定量PCR检测，根据检测结果判断待测样本中是否存在猪星状病毒5型；
[0019]所述荧光定量PCR引物的序列如下所示：
[0020]Forward 1：5
’‑
AATGTGCGTGTGAAAGAGCG
‑3’
；
[0021]Reverse 1：5
’‑
CATCATAGCGGGTCCAGTCC
‑3’
。
[0022]作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述逆转录的反应体系为：5
×
HiScript II Q RT SuperMix 4μL，模板RNA 1μL，RNase
‑
free ddH2O补至20μL。
[0023]作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述逆转录的反应程序为：50℃15min，85℃5s。
[0024]作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述探针的序列如下所示：
[0025]Probe：5
’‑
(FAM)ACAACGCCTGGCTTCAACCGGAGCA(BHQ1)
‑3’
。
[0026]作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述实时荧光定量PCR的反应体系为：qPCR Mix(即扩增反应缓冲液，可由Toyobo提供)10μL，上下游引物(Forward 1/Reverse 1)各0.5μL，探针1μL，模板2μL，H2O 6μL，共计20μL。
[0027]作为本专利技术一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃1min，40个循环，延伸时采集荧光信号。
[0028]本专利技术的有益效果：
[0029]本专利技术以猪星状病毒5型毒株的ORF1ab基因的高度保守区作为靶基因，经普通PCR及荧光定量PCR鉴定灵敏性后筛选出一对PCR引物，并据此设计合成TaqMan探针，制备用于检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂。经验证，除PAstV
‑
5型外，该检测试剂对PRV、PPV、TGEV、PEDV病毒等均没有特征性扩增曲线，特异性和重复性良好，检测结果准确、可靠。
[0030]本专利技术还提供了一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR方法，具有良好的敏感性、特异性和稳定性，可检测到最低浓度为10copies/μL的病毒RNA，比常规RT
‑
PCR方法的敏感性高100倍，对临床采集的100份阳性待检病料进行检测，符合率良好。
附图说明
[0031]图1为试验例中普通PCR扩增结果；
[0032]图中，M：DNA分子质量标准；1：阴性对照；2
‑
11：依次为第1
‑
10对引物扩增产物。
[0033]图2为试验例中荧光定量PCR扩增结果；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR试剂，其特征在于：所述试剂包括荧光定量PCR引物和探针；所述荧光定量PCR引物的序列如下所示：Forward 1：5
’‑
AATGTGCGTGTGAAAGAGCG
‑3’
；Reverse 1：5
’‑
CATCATAGCGGGTCCAGTCC
‑3’
。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述探针的序列如下所示：Probe：5
’‑
(FAM)ACAACGCCTGGCTTCAACCGGAGCA(BHQ1)
‑3’
。3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括逆转录酶、逆转录反应缓冲液、DNA聚合酶、扩增反应缓冲液中的一种或多种。4.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括阴性对照、阳性对照、标准品中的一种或多种。5.一种检测猪星状病毒5型的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)以待测样本中RNA为模板进行逆转录，得到cDNA；(2)以cDNA模板，加入荧光定量PCR引物和探针，进行实时荧光定量PCR检测，根据检测结果判断待测样本中是否存在猪星状病毒5型；所述荧光定量PCR引物的序列如下所示：Forward 1：5
’‑
AAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：万博，郭娟娟，张雨杭，何文瑞，韩世充，张改平，王亚楠，胡曼，王攀，钟函，柳顺达，郭科威，凌向辉，付云龙，韩光晖，宋智慧，
申请(专利权)人：河南格悦检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：