抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用制造技术

本申请涉及一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用，属于猪星状病毒检测技术领域。本发明专利技术的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株的制备方法包括如下步骤：1)采用pET32a

【技术实现步骤摘要】
抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用


[0001]本专利技术涉及猪星状病毒检测
，更具体地说，涉及一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体及其引物、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪星状病毒PAstV首次由Bridger通过电镜在3周龄的乳猪腹泻粪样中观察到，PAstV感染猪后可引起腹泻、呕吐、脱水和生长迟缓等临床症状，PAstV常与冠状病毒、嵌杯状病毒、轮状病毒及其他肠道病毒混合感染造成猪急性胃肠炎。有学者认为PAstV是引起近年来仔猪病毒性腹泻疫情的主要病原之一，对断奶前仔猪侵害尤为严重，给养猪业带来了巨大影响。
[0003]星状病毒无囊膜，为单股、正链RNA病毒，基因组全长6.4
–
7.8kb，病毒颗粒直径大约是28
–
30nm。星状病毒由5
’
和3
’
非翻译区(Untranslated region，UTR)、三个开放阅读框Open reading frames(ORF1a、ORF1b、ORF2)和poly(A)组成。ORF1a和ORF1b位于基因组的5
’
端，在ORF1a/b的交界处有一个七核苷酸(AAAAAAC)的核糖体框架移位信号(RFS)，序列高度保守。整个ORF1编码非结构蛋白nsp1a和nsp1ab，它们通过蛋白水解加工成较小的蛋白，包括RNA依赖性RNA聚合酶，丝氨酸蛋白酶，病毒基因组相关蛋白(VPg)和其他几种功能未知的蛋白质。ORF2编码结构蛋白(衣壳蛋白CP)。在所有星状病毒中，衣壳蛋白的N末端比C末端更加保守，因为所有星状病毒的衣壳蛋白均在N端包含一个富含碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)区域，该区域被认为与病毒内部的基因组RNA相互作用。
[0004]星状病毒具有基因多型性与变异性,可以发生基因重组,使其具有不俗的适应宿主能力和跨种间传播能力,具有潜在的人畜共患风险。ORF1a区域内可以发生基因重组，除此之外，ORF1b和ORF2的重叠区是发生同源重组的高频区域，该区域内含有一个相对稳定的发夹结构，重组主要发生在这个发夹结构区域。
[0005]Jonassen等人研究发现人、猫星状病毒和PAstV遗传距离最相近，提示星状病毒在进化过程中存在种间交叉传播，有可能是猪传给猫、猫再传给人或者通过中间宿主进行传播。Ulloa等人发现，来自住在同一栋房子的人及猪腹泻样品中人星状病毒和PAstV部分基因出现重组，认为星状病毒可能存在种间交叉传播。星状病毒的多宿主性、基因差异性及其重组现象和跨种间传播及适应新宿主的能力，使得星状病毒成为潜在的新兴人畜共患病原，因此，对猪星状病毒的及时检测发现并控制具有重要的公共卫生价值。
[0006]目前已发现的猪星状病毒基因型共有5种(PoAstV1
‑
5)，序列分析表明五种基因型之间差异很大，基因组彼此间同源性只有40％左右，这也反映出PoAstV间巨大的遗传差异，这也导致对这五种猪星状病毒的检测方法的差异性非常大，相互之间的借鉴意义很小。
[0007]在猪星状病毒的抗体检测方面，针对猪星状病毒1型的检测研究较多，例如《猪星状病毒1型衣壳蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备》(中国预防兽医学报，王蔚怡等，2021.4)公开了一种猪星状病毒1型多克隆抗体的制备方法，该方法根据PAstV
‑
GX1株Cap蛋
白Cs(aa420
‑
aa669)基因序列设计引物，PCR扩增该片段(Cs)后克隆于pET
‑
32a(+)原核表达载体，构建重组表达质粒pET32a
‑
Cs，将其转化E.coli BL21感受态细胞，经终浓度1mmol/L的IPTG在37℃诱导6h后经SDS
‑
PAGE检测表达产物，结果显示在大约47ku处出现目的蛋白，且该蛋白以可溶性形式表达。将重组Cs蛋白经Ni柱纯化后乳化，按100μg/只免疫6周龄BALB/c小鼠，三免后5d采血分离血清，经western blot和间接免疫荧光检测结果显示，获得的Cap蛋白高变区多克隆抗体可特异性识别PAstV
‑
GX1感染的PK15细胞表达的病毒蛋白。
[0008]但是，对其他型的猪星状病毒的抗体检测还未见报道，特别是对猪星状病毒5型的检测，难度更大一些，这主要是跟猪星状病毒5型的结构有关系。
[0009]2011年在加拿大养猪场成年猪盲肠内粪便标本中发现一种新型PAstV，这种PAstV无法用病毒通用引物检测，因为这株病毒并没有在多种病毒内均存在的高度保守的s2m茎环结构。对毒株进行系统发育分析，发现其在哺乳动物病毒科中形成了一个独特的谱系，这株PAstV与经典型的PoAstV
‑
1仅有25％
‑
30％的氨基酸同源性，且与其他三种PAstV基因型均存在一定的遗传距离，于是将其命名为PAstV
‑
5。
[0010]中国国内第一株PAstV
‑
5(KP747574)序列是2015年在健康家养仔猪中检测到的，且中国最早发现的三株PoAstV
‑
5并不分布在同一进化枝上，呈现较为复杂的分布，PoAstV
‑
5的遗传性多样且复杂。因此，如何开发一种与PAstV5血清特异性结合效果好且效价较高的酶标抗体具有重要的意义。

技术实现思路

[0011]为了提高抗体与PAstV5血清特异性结合效果，本申请提供一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体及其引物、制备方法和应用。
[0012]一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用PCR引物，所述引物的核苷酸序列如下：
[0013]P1:5
’‑
ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt
‑3’
；
[0014]P2:5
’‑
aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg
‑3’
。
[0015]一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC N0:C2022393的杂交瘤细胞株产生。
[0016]一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC N0:C2022393。
[0017]一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：
[0018]1)采用pET32a
‑
PAstV5
‑
Cap
‑
1融合蛋白对小鼠进行免疫；
[0019]2)取步骤1)中免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；
[0020]3)对步骤2)制得的杂交瘤细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；
[0021]4)对步骤3)筛选得到的阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗猪星状病毒五型PAstV5抗原制备用PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：P1:5
’‑
ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt
‑3’
；P2:5
’‑
aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg
‑3’
。2.一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏编号为CCTCC N0:C2022393。3.一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCC N0:C2022393的杂交瘤细胞株产生。4.一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，利用保藏编号为CCTCC N0:C2022393的杂交瘤细胞株分泌产生抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的抗猪星...

【专利技术属性】
技术研发人员：万博，张改平，郭娟娟，张雨杭，何文瑞，韩世充，王亚楠，李华玮，王攀，钟函，任豪杰，柳顺达，付云龙，
申请(专利权)人：河南格悦检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：