引物探针组合以及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测试剂领域，特别涉及引物探针组合以及试剂盒。本发明专利技术提供的引物探针组具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8任一所示的核苷酸序列的引物和具有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.9任一所示的核苷酸序列的探针。该引物探针组及其试剂盒具有灵敏、特异、抗干扰性强和稳定性高等特点。抗干扰性强和稳定性高等特点。

【技术实现步骤摘要】
引物探针组合以及试剂盒


[0001]本专利技术涉及检测试剂领域，特别涉及引物探针组合以及试剂盒。

技术介绍

[0002]呼吸道感染分上呼吸道感染和下呼吸道感染，从病原体分又分为病毒感染和细菌感染，但由于各种不同的呼吸道病原体感染导致的症状体征基本相同，均表现急性起病，高热，咳嗽，可伴有寒战，呼吸道分泌物增加等，但针对不同病原体的治疗方法却大相径庭，比如不同的病毒需要不同类型的抗病毒药物，不同的细菌所需要的抗菌素种类区别也很大。而且不同类型病原体感染导致的风险程度也大不相同，有些可以自愈，有些则可能导致严重的并发症危及生命，有些甚至可能导致严重呼吸道传染病的迅速传播和爆发。因此在临床诊疗中尽快确定感染病原体的种类非常关键，这对于尽快采取特异性治疗措施，从而减少药物滥用、为提高患者治愈率和存活率争取宝贵的时间。降低社会医疗负担和支出，乃至及早发现和排查新型突发性呼吸道传染病病原体都非常重要。
[0003]但在目前的临床实践中，都是采用单个靶标的病原体体检测，医生往往依据流行病信息经验、理化、影像等从可能性较高的病原体开始检查并逐步排除，但这种做法耗时长、高成本，加剧病人痛苦、贻误治疗的最佳时机。为此，很多时候医生只能在没有明确病原学诊断的情况下盲目经验性给药，这又造成了药物滥用，增加了毒副作用和病原体耐药的机率，还造成医疗资源浪费，同时也无益于提高疗效。因此，国内外学者多年来一直致力于研发多靶标同时检测的技术，但是多对引物探针存在于一个反应体系中会导致难以想象的复杂局面：
[0004]众所周知，不同靶标的引物探针之间如果存在数个连续的碱基互补，则很有可能在聚合酶作用下相互结合产生扩增延伸，导致大量的非特异假阳性扩增产物。连续三个碱基与其它序列相同的概率为1/4
×
1/4
×
1/4＝1/64，显然随着引物探针数量的增加，发生不同序列间相互重叠的或互补的几率将迅速增加，甚至几乎无法避免，因此以往用于单靶标检测的引物探针将不适用。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了引物探针组合以及试剂盒，其具有灵敏、特异、抗干扰性强和稳定性高等特点。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了引物探针组，包括：
[0008](1)、具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8任一所示的核苷酸序列的引物；和
[0009](2)、具有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.9任一所示的核苷酸序列的探针。
[0010]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述引物探针组还包括：
NO.3(20mM)、1μL SEQ ID NO.4(20mM)、1μL SEQ ID NO.5(20mM)、0.5μL SEQ ID NO.6(20mM)、1μL SEQ ID NO.7(20mM)、1μL SEQ ID NO.8(20mM)、0.5μL SEQ ID NO.9(20mM)、0.8μL SEQ ID NO.10(20mM)、0.8μL SEQ ID NO.11(20mM)和0.4μL SEQ ID NO.12(20mM)，用灭菌纯化水和核酸模板补足至50μL。
[0033]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物探针组或所述试剂盒的反应程序包括：50℃2min；95℃预变性2min；95℃变性15s；60℃退火30s，返回变性然后退火并如此重复45个循环；25℃冷却10s。
[0034]本专利技术还提供了试剂盒，包括上述引物探针组以及可接受的辅料或助剂。
[0035]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的辅料或助剂包括DMSO、TMAC、SSB、甲酰胺、海藻糖、甜菜碱和/或非离子型洗涤剂。
[0036]在本专利技术的一些具体实施方案中，试剂盒还包括反应试剂；所述试剂包括dNTPs、UDG酶、Tth酶和/或MgCl2中的一种或多种。
[0037]本专利技术还提供了检测方法，包括使用上述引物探针组进行Real time PCR，根据检测得出的Ct值判断样品是否存在鲍曼不动杆菌基因、嗜麦芽窄食单胞菌基因或者洋葱伯克霍尔德菌基因中的一种或多种。
[0038]本专利技术的引物探针组有如下效果：
[0039]1、本专利技术的引物探针组检测不同样品时比同一批设计的引物探针组的Ct值整体较低，且信号强度整体较高，说明本专利技术的引物探针组合扩增效率较高。
[0040]2、最低检测限试验结果表明，本专利技术的引物探针组的检测限：鲍曼不动杆菌为500copies/mL；嗜麦芽窄食单胞菌为500copies/mL；洋葱伯克霍尔德菌为500copies/mL。
[0041]3、交叉反应试验结果表明，本专利技术的引物探针组对金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、变性杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌等病原体感染样本无交叉反应，表明本专利技术的引物探针组其具有高特异性。
[0042]4、抗干扰性试验结果表明，当样本中含有200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素等内源性干扰物质时，本专利技术试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰。说明本专利技术的引物探针组具有良好的抗干扰性。
[0043]5、稳定性试验结果表明，2～8℃运输7天、45℃加速7、10、14天的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂仍能检出阳性样品。2～8℃保存3、6、9、12个月的鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌核酸检测试剂仍能检出阳性样品。说明本专利技术的引物探针组具有良好的稳定性。
附图说明
[0044]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0045]图1示鲍曼不动杆菌引物探针筛选扩增曲线；其中，横坐标为循环数；
[0046]图2示嗜麦芽窄食单胞菌引物探针筛选扩增曲线；其中，横坐标为循环数；
[0047]图3示洋葱伯克霍尔德菌引物探针筛选扩增曲线；其中，横坐标为循环数。
具体实施方式
[0048]本专利技术公开了引物探针组合以及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0049]解决
技术介绍
所述的问题的办法就是重新精心设计引物探针，尽可能使各个靶标的引物探针序列之间的差别足够大，以至于不出现互补区域。而这却导致了各个引物探针之间的熔解温度(TM值)的巨大差异。众所周知，TM值与DNA片段的长度以及G
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.引物探针组，其特征在于，其包括：(1)、具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8任一所示的核苷酸序列的引物；和(2)、具有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.9任一所示的核苷酸序列的探针。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，其还包括：(3)、具有如SEQ ID NO.10和/或SEQ ID NO.11所示核苷酸序列引物；和(4)、具有如SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的探针。3.如权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，其还具有：(5)、如(1)～(4)任一所示的核苷酸序列的互补序列；和/或(6)、如(1)～(5)任一所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)～(4)任一所示的相同或相似；和/或(7)、与(1)～(6)任一所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。4.如权利要求1至3任一项所述的引物探针组在制备用于鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和/或洋葱伯克霍尔德菌检测试剂盒中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物探针组或所述试剂盒的检测结果的判断标准包括：如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.9所示探针通道CT值＞30或者无CT值，且SEQ ID NO.12所示探针通道的CT值≤35，报告检测结果为阴性；和/或如SEQ ID NO.3所示探针通道的CT值≤30，但SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9所示探针通道CT值＞30，报告为鲍曼不动杆菌阳性；和/或如SEQ ID NO.6所示探针通道的CT值≤30，但SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9所示探针通道CT值＞30，报告为嗜麦芽窄食单胞菌阳性；和/或如SEQ ID NO.9所示探针通道的CT值≤30，但SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示探针通道CT值＞30，报告...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰定云，李进福，景培源，慎津进，薛寒，高利飞，郑业焕，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：