多个靶核酸的同时检测方法技术

本发明专利技术的课题在于，提供能够简便且更低成本地同时鉴别多个靶核酸的方法。本发明专利技术提供一种在一个反应液中通过熔解曲线分析检测多个靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括向反应液中添加检测第一靶核酸的第一靶用探针和检测第二靶核酸的第二靶用探针的工序，其中，第一靶用探针和第二靶用探针在将熔解曲线分析中的各自的检测温度设为T1和T2时满足T1＞T2，并且分别用能在同一波长下检测的标记物进行了标记。行了标记。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多个靶核酸的同时检测方法


[0001]本专利技术涉及以简便的方法同时检测试样中包含的多个靶核酸的方法和该方法中使用的试剂组合物等。

技术介绍

[0002]各种感染症中有许多临床症状极为相似、很难对其鉴别者。例如，性传播疾病中的衣原体感染症与淋球菌感染症等的症状极为相似，其鉴别在临床上变得尤为重要。因此，开发出了利用以PCR法为代表的各种检测法同时进行鉴别的方法。
[0003]在PCR法等的基因检测中，作为需要同时测定多个靶基因的场景，例如不仅可列举出上述那样的性传播疾病的衣原体和淋球菌，还可列举出甲型流感和乙型流感等。在这种临床症状极为相似的感染症的检查中，要求能够通过来自同一待检体的基因检测同时进行鉴别。
[0004]作为其理由之一，由于上述那样的多种感染症的症状极为相似，因此在发生了共感染的情况下也有可能发生一种感染的漏诊。此情况下，不仅延误治疗，而且还担心感染向周围扩散。在这种情况下，如果能够同时鉴别症状极为相似的病原性微生物，则不仅能够进行早期治疗，而且还可防止对周围的感染。
[0005]迄今为止，作为同时检测多个靶核酸的方法，广泛进行了如下方法：使用不同的反应液分别实施测定的方法(专利文献1)；或者，通过在各自的检测中使用波长不同的标记物来进行识别的方法(专利文献2)等。
[0006]然而，如专利文献1那样使用不同的反应液分别实施测定的情况下，存在分析用试剂制备的准备时间、试剂的成本加倍等课题。
[0007]另外，如专利文献2那样在各自的检测中使用波长不同的标记物进行测定的情况下，在具备多种荧光检测通道的分析装置的选择、待检测的波长的设定等方面花费时间和成本。
[0008]进而，还知晓如下方法：通过组合探针的退火温度条件设定和温度变化曲线，从而在一个反应容器中使用单一荧光标记来同时检测多种核酸(专利文献3)。然而，该方法存在如下课题：需要针对每种探针来大幅改变探针的碱基长度等，探针的设计、条件设定等会复杂化，成本增加。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]专利文献1：日本特开2002
‑
136300号公报
[0012]专利文献2：日本特开2004
‑
203号公报
[0013]专利文献3：日本特开2017
‑
521758号公报

技术实现思路

[0014]专利技术要解决的问题
[0015]本专利技术是以上述现有课题作为背景而完成的。即，目的在于开发出能够简便且更低成本地同时识别多个靶核酸的新型方法。
[0016]用于解决问题的方案
[0017]本专利技术人进行了深入研究，结果意外地发现：如果在使用探针的熔解曲线分析中，按照使多个靶标用探针的检测温度彼此偏离一定程度的方式进行设计，则即使通过能在同一波长下检测它们的标记物进行标记，也可清楚地观察到用各自的靶标用探针的荧光/淬灭变化量的一次微分值表示的2个峰，能够通过同一波长的检测识别多个靶核酸。为了设计成使靶标用探针的检测温度彼此偏离一定程度，例如，可以通过在多个靶标用探针中的任一者中导入错配碱基来实现。本专利技术基于该发现并进行了进一步研究而完成。
[0018]即，本专利技术的概要如下所述。
[0019][项目1]一种在一个反应液中通过熔解曲线分析检测多个靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括向反应液中添加检测第一靶核酸的第一靶用探针和检测第二靶核酸的第二靶用探针的工序，其中，第一靶用探针和第二靶用探针在将熔解曲线分析中的各自的检测温度设为T1和T2时满足T1＞T2，并且分别用能在同一波长下检测的标记物进行了标记。
[0020][项目2]根据项目1所述的方法，其还包括通过如下引物扩增第一靶核酸和第二靶核酸的工序，所述引物为：能够扩增包含可被第一靶用探针结合的第一靶核酸序列的区域的1个以上的第一靶用引物；以及能够扩增包含可被第二靶用探针结合的第二靶核酸序列的区域的1个以上的第二靶用引物。
[0021][项目3]根据项目1或2所述的方法，其中，第一靶用探针的标记物与第二靶用探针的标记物为相同的标记物。
[0022][项目4]根据项目1～3中任一项所述的方法，其中，第二靶用探针包含错配碱基。
[0023][项目5]根据项目1～4中任一项所述的方法，其中，错配碱基为选自由腺嘌呤碱基、胞嘧啶碱基、鸟嘌呤碱基、胸腺嘧啶碱基、和通用碱基组成的组中的至少1种。
[0024][项目6]根据项目1～5中任一项所述的方法，其中，通用碱基为选自由次黄嘌呤、9
‑
(Β
‑
D
‑
呋喃核糖)嘌呤(Nebularine)、和5
‑
硝基吲哚组成的组中的至少1种。
[0025][项目7]根据项目1～6中任一项所述的方法，其中，通过使第一靶用探针不包含错配碱基、使第二靶用探针包含错配碱基，从而被调整为在熔解曲线分析中第二靶用探针的检测温度T2相比于第一靶用探针的检测温度T1在低温侧。
[0026][项目8]根据项目1～7中任一项所述的方法，其中，在熔解曲线分析中，第一靶用探针的检测温度T1与第二靶用探针的检测温度T2的温度差为5～30℃。
[0027][项目9]根据项目1～8中任一项所述的方法，其中，第一靶用探针的核酸碱基的长度与第二靶用探针的核酸碱基的长度之差为8mer以下。
[0028][项目10]根据项目1～10中任一项所述的方法，其中，第一靶用探针的标记物和第二靶用探针的标记物为Qprobe(注册商标)或Eprobe(注册商标)。
[0029][项目11]根据项目1～10中任一项所述的方法，其中，第一靶核酸和第二靶核酸中的任一者为衣原体内源性质粒中的靶核酸，另一者为淋球菌中的靶核酸。
[0030][项目12]根据项目1～10中任一项所述的方法，其中，第一靶核酸和第二靶核酸中的任一者为nuc基因中的靶核酸，另一者为mecA基因中的靶核酸。
[0031][项目13]根据项目1～10中任一项所述的方法，其中，第一靶核酸和第二靶核酸中的任一者为甲型流感中的靶核酸，另一者为乙型流感中的靶核酸。
[0032][项目14]一种试剂盒，其特征在于，为用于在一个反应液中通过熔解曲线分析检测多个靶核酸的核酸检测试剂盒，所述试剂盒至少包含检测第一靶核酸的第一靶用探针和检测第二靶核酸的第二靶用探针，第一靶用探针和第二靶用探针设计成在将熔解曲线分析中的各自的检测温度设为T1和T2时满足T1＞T2，且分别用能在同一波长下检测的标记物进行了标记。
[0033][项目15]根据项目14所述的试剂盒，其还包含如下引物：能够扩增包含可被第一靶用探针结合的第一靶核酸序列的区域的1个以上的第一靶用引物；以及能够扩增包含可被第二靶用探针结合的第二靶核酸序列的区域的1个以上的第二靶用引物。
[0034]专利技术的效果
[0035]根据本专利技术，不再需要以往在用基因检测识别多个靶核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在一个反应液中通过熔解曲线分析检测多个靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括向反应液中添加检测第一靶核酸的第一靶用探针和检测第二靶核酸的第二靶用探针的工序，其中，第一靶用探针和第二靶用探针在将熔解曲线分析中的各自的检测温度设为T1和T2时满足T1＞T2，并且分别用能在同一波长下检测的标记物进行了标记。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括通过如下引物扩增第一靶核酸和第二靶核酸的工序，所述引物为：能够扩增包含可被第一靶用探针结合的第一靶核酸序列的区域的1个以上的第一靶用引物；以及能够扩增包含可被第二靶用探针结合的第二靶核酸序列的区域的1个以上的第二靶用引物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一靶用探针的标记物与第二靶用探针的标记物为相同的标记物。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，第二靶用探针包含错配碱基。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，错配碱基为选自由腺嘌呤碱基、胞嘧啶碱基、鸟嘌呤碱基、胸腺嘧啶碱基、和通用碱基组成的组中的至少1种。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，通用碱基为选自由次黄嘌呤、9
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(Β
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D
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呋喃核糖)嘌呤、和5
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硝基吲哚组成的组中的至少1种。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，通过使第一靶用探针不包含错配碱基、使第二靶用探针包含错配碱基，从而被调整为在熔解曲线分析中第二靶用探针的检测温度T2相比于第一靶用探针的检测温度T1在低温侧。8.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：道渕真史，上仓佳子，铃木广道，
申请(专利权)人：东洋纺株式会社，
类型：发明
国别省市：